신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양
Summary
표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.
Abstract
keratinocyte (KC)는 피부의 가장 바깥 쪽 레이어 인 표피의 주된 세포 타입입니다. 표피 KCs는 UVB 조사 또는 병원체와 같은 환경 모욕에 대하여 온전한 피부 장벽을 형성하고 또한 그 모욕에 염증 반응을 개시해서 피부 방위를 제공에있는 긴요 한 역할을한다. 여기에서는 신생아 마우스 피부 및 성인 마우스 꼬리 피부에서 KC를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 cheleed 태아 소 혈청 (cFBS)에 비해 정의 성장 보조제 (dGS)를 사용하여 culturing 조건을 설명합니다. 기능적으로, 우리는 신생아 및 성인 KC 모두가 높은 칼슘 – 유도 된 말단 분화, 단단한 접합 형성 및 층화에 매우 반응한다는 것을 보여준다. 또한, 배양 된 성인 KC는 UVB에 의해 유발 된 세포 사멸에 민감하며 UVB 조사시 다량의 TNF를 방출 할 수 있습니다. 함께 여기에 설명 된 방법 은 체외 모델의 설정에 대한 연구자에게 유용 할 것입니다신생아 마우스 및 / 또는 성인 마우스에서 표피 생물학을 연구합니다.
Introduction
피부는 신체에서 가장 큰 기관이며 표피는 바깥쪽에 가장 많이 있습니다. 표피는 신체와 환경을 분리하기 위해 손상되지 않은 표피 장벽을 형성하는데 결정적인 역할을하므로 물 손실을 방지하고 알레르기 항원, 병원체 및 UVB 노출과 같은 환경 모욕으로부터 보호합니다. 표피는 미분화 된 기저 각질 세포 (KCs)의 단일 층에서부터 기저층, 가시 돌기 층, 과립층 및 각질층으로 구성된 다층 층상 상피로 발전한다. 표피 줄기 세포와 중계 증폭 세포로 구성된 기초 KC는 증식 성이 있고 미분화되어있다. 기초 KC가 세포주기를 빠져 나감에 따라, 세포는 분화를 결정하고 세포 – 세포 접합의 성숙과 표피 투과성 장벽 (epidermal permeability barrier, EPB)의 형성과 함께 표피 표면을 향해 서서히 이동한다. 가시 광선 층의 KC는 초기 별 차이를 표현합니다.케라틴 10 (K10)과 같은 이온 마커; KCs가 세분화 된 층으로 이동함에 따라 세포는 Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) 및 Involucrin (INV)과 같은 후기 분화 마커를 발현합니다. 각질층에서 KC는 말단 분화 된 각질 세포가되어 새로운 세포가 그들을 대체 할 때 결국 박리를 통해 흘러 나온다.
칼슘은 표피에서 가장 생리적 인 작용제로 간주 되며 in vitro 및 in vivo 에서 유사한 방식으로 분화 를 유발합니다. 정상 피부 표피에서는 칼슘 이온이 피부 표면을 향한 농도가 증가하는 특징적인 "농도 구배"를 형성합니다 1 , 2 , 3 . 칼슘 농도는 가장 낮은 층 (기저부 및 가시 돌기)의 낮은 수준에서 상부의 과립층의 첨단으로 상승한 다음 가장 표면적인 층 (각질층)에서는 무시할 수있는 수준으로 떨어집니다. 칼슘 구배는 성분 투과성 장벽의 출현과 동시에 발생하며 칼슘 신호 전달이 KC 분화의 중요한 역할을한다는 것을지지합니다. 시험 관내 에서 낮은 칼슘 (0.02-0.1 mM)은 단일 층으로서 기저부 KCs의 증식을 유지하지만, 높은 칼슘 (> 0.1 mM)은 단단 – 접합 형성 및 유도에 의해 입증 된 바와 같이 말단 분화에 대한 세포의 신속하고 돌이킬 수없는 공약을 유도한다 기초 칼슘 4 , 5 에 대한 높은 칼슘 처리시 LOR 및 INV
장벽 형성 외에도 표피 KC는 피부의 타고난 면역계의 중요한 구성 요소입니다. UVB 조사 또는 손상시 방출되는 병원균 또는 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)에 대한 반응으로 KC는 TNFα, IL6 및 IFNβ와 같은 염증성 사이토 카인을 대량 생산하여 면역계 활성화를 유도합니다> 6 , 7 , 8 , 9 . 병원균 제거를 위해서는 KC로부터의 적절한 염증 신호가 필요하지만 통제되지 않은 염증 반응은 건선이나 주사와 같은자가 염증성 피부 질환의 발병을 유발할 수 있습니다 6 , 8 .
전반적으로, KC는 손상되지 않은 피부 장벽을 유지하고 병원균 침입 또는 환경 모욕시 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을합니다. 그러므로 상피 세포의 일차 배양은 상피 생물학, KC 분화 및 KC 자극에 의한 타고난 면역 반응을 연구하는데 유용한 기술이다. 주요 마우스 표피 KC의 분리 및 배양은 KC의 다양한 자각 감수성 및 감수성으로 인해 어려운 과정이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스 피부에서 KCs를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다성인 마우스 꼬리 피부. 성인 KC 격리의 경우, 우리는 다음과 같은 이유로이 조직에서 생존 가능한 KC를 충분히 분리하기가 어려울 수 있으므로 마우스 등쪽 피부를 사용하지 않습니다. 첫째, 모발주기 (휴지기)의 휴지기에있는 성인의 지느러미 피부는 얇은 표피는 단지 1-2 층의 세포로 이루어지기 때문에 낮은 세포 수율과 표피와 진피의 비효율적 인 분리가 이루어 지는데, 이것은 성공적인 KC 격리를위한 중요한 단계입니다. 둘째로, 성인의 지느러미 피부에 존재하는 높은 모낭 밀도는 진피에서 표피를 분리하는 어려움에 더 기여합니다. 대신, 우리는 일상적으로 꼬리 피부를 성인 마우스 KCs의 공급원으로 사용합니다.이 상피는 표피 KC 3-5 층으로 두껍습니다. 또한 모낭의 밀도가 낮아 표피 분리를 방해하지 않으므로 마우스의 나이와 머리카락 순환 단계에 관계없이 성인 마우스 꼬리 피부와 KC 격리가 가능합니다. 고립 된 신비탈크 KC는 젤라틴 코팅 배양 접시에 뿌리는 반면, 콜라겐 코팅 배양 접시는 성숙한 세포가 신생아 대응 물과 비교할 때 손상된 능력 때문에 분리 된 성인 KC를 배양하는데 사용됩니다. 마우스 KC를 배양하기 위해 저칼슘 기저 배지에는 표피 성장 인자 (EGF), 소 트랜스페린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 하이드로 코르티손이 포함 된 dGS가 보충된다. 초기 도금 후 2-4 일 사이에 대부분의 분화 된 KC는 매일 중간 배양 중에 씻겨 나갈 수 있고 나머지 접착 세포는 전형적인 조약돌 형태 4를 나타내며 증식하고 초기 분화 마커 K10을 발현하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
피부 표피는 몸을 외부 환경으로부터 분리 및 보호하고 수분 손실, 병원체, 열 및 자외선 조사로 인한 손상을 방지하는 중요한 장벽으로 작용합니다. KC는 표피의 주된 세포 계통이며 표피 KC의 일차 배양은 장벽 형성의 생물학적 과정과 in vitro에서의 환경 모욕 에 대한 KCs의 반응을 연구하고 이해하는 데 유용한 도구입니다.
여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 내과학 연구소 (R01AR069653 to Zhang LJ)와 국립 보건원 (National Institute of Health Support) (5T32AR062496-03 to CA)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).
