בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר
Summary
אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.
Abstract
הקרטינוציטים (KC) הוא סוג התא השולט באפידרמיס, השכבה החיצונית ביותר של העור. לקרני אפידרמיס תפקיד קריטי במתן הגנה על העור על ידי יצירת מחסום עור שלם נגד עלבונות סביבתיים, כגון קרינה UVB או פתוגנים, וכן על ידי ייזום תגובה דלקתית על עלבונות אלה. כאן אנו מתארים שיטות לבודד KCs מעכבר העכבר הילוד ומבוגר העור זנב העכבר. כמו כן, אנו מתארים תנאים מתרבים באמצעות תוספי תזונה מוגדרים (dGS) בהשוואה לסרום של שור עוברית (cFBS). באופן פונקציונלי, אנו מראים כי הן Kons ניאונטליים ומבוגר הם מגיבים מאוד להבדיל גבוהה סידן המושרה מסוף, הצומת הצומת הדוק ריבוד. בנוסף, KCs מבוגר תרבותי רגישים למוות התא מופעלת UVB והוא יכול לשחרר כמויות גדולות של TNF על קרינה UVB. יחד, השיטות המתוארות כאן יהיה שימושי לחוקרים עבור ההתקנה של מודל במבחנהS ללמוד ביולוגיה האפידרמיס בעכבר הילוד ו / או העכבר הבוגר.
Introduction
העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף עם האפידרמיס כמו השכבה החיצונית ביותר. האפידרמיס משחק תפקיד קריטי ביצירת מחסום אפידרמיס שלם כדי להפריד את הגוף מן הסביבה, ובכך מונע אובדן מים ומספק הגנה מפני עלבונות סביבתיים, כגון אלרגנים, פתוגנים וחשיפה UVB. האפידרמיס מתפתח משכבה אחת של קרטינוציטים בסיסיים לא מובחנים (KC) לתוך שכבת ביצה מרובת שכבות המורכבת משכבה בסיסית, ואחריה שכבה ספינית, שכבה גרגרנית ושכבת שכבה. KCs Basal, המורכב משני תאי גזע האפידרמיס ותאי הגברה טרנזיט, הם שגשוג ולא מובחן. כמו KCs בסיסית לצאת מחזור התא, התאים להתחייב להבחנה בהדרגה נודדים לעבר פני השטח של האפידרמיס, מלווה התבגרות של תאים סלולריים צמתים ויצירת מחסום חדירות epidermal (EPB). KCs על שכבת spinous להביע מוקדם differiatיונים כגון קראטין 10 (K10); כמו KCs נודדים לשכבה פרטנית, התאים להביע סמנים הבחנה מאוחר כגון Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) ו Involucrin (INV). בשכבת הקרנית, ה- KC הופכים לקרניאוציות מובחנות סופיות, אשר בסופו של דבר לשפוך באמצעות desquamation כמו תאים חדשים להחליף אותם.
סידן נחשב סוכן פיזיולוגי ביותר האפידרמיס ומפעיל differiation במבחנה in vivo באופן דומה. ב עור רגיל אפידרמיס, יוני סידן טופס אופייני "ריכוז שיפוע", הגדלת הריכוז לעבר פני העור 1 , 2 , 3 . ריכוז הסידן עולה מרמות נמוכות בשכבות המשנה התחתונות (שכבות בסיסיות וספיןיות) לשיא בשכבה הגרעינית העליונה ולאחר מכן יורד לרמות זניחות בשכבה השטחית ביותר (שכבת הקרנית). הסידן שיפוע גם מפתחת מקריות עם הופעתה של מחסום חדירות רכיב, אשר תומך כי סידן איתות משחק תפקיד קריטי של בידול KC. במבחנה , סידן נמוך (0.02-0.1 מ"מ) שומר על התפשטות של KCs בסיסי כמו monolayer, ואילו סידן גבוהה (> 0.1 מ"מ) גורם למחויבות מהירה בלתי הפיך של התאים לבידול הטרמינל כפי שהוכח על ידי הצומת הצומת הדוק אינדוקציה של LOR ו INV על טיפול סידן גבוהה על בסיס KCs 4 , 5 .
בנוסף היווצרות המכשול, KCs האפידרמיס הם גם מרכיב חשוב של מערכת החיסון המולדת של העור. בתגובה לפתוגנים או לדפוסים מולקולאריים פגומים (DAMP) שפורסמו על קרינה UVB או פגיעה, KCs יכול לייצר כמויות גדולות של ציטוקינים דלקתיים, כגון TNFα, IL6 ו IFNβ, המוביל ההפעלה המערכת החיסונית> 6 , 7 , 8 , 9 . למרות איתות דלקתיות נכון מ KCs נדרש פינוי הפתוגן, תגובה דלקתית בלתי מבוקרת עלולה לגרום להתפתחות של מחלות עור דלקתיות אוטומטי, כגון פסוריאזיס ו רוזצצה 6 , 8 .
בסך הכל, KCs לשחק תפקיד חיוני בשמירה על מחסום עור שלם ויזום תגובה חיסונית על פלישה הפתוגן או עלבונות סביבתיים. לכן, התרבות העיקרית של KCs האפידרמיס היא טכניקה שימושית ללמוד ביולוגיה אפיתל, בידול KC, כמו גם KC- מגורה תגובות החיסון המולדת. הבידוד והתרבות של KCs האפידרמיס העכבר הראשוני יכול להיות תהליך מאתגר בשל רגישות של KC ורגישות גירויים חיצוניים שונים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד KCs תרבות מעכבר העכבר neonatal אועכבר מבוגר זנב עור. עבור בידוד KC מבוגר, אנחנו לא משתמשים בעור הגב של העכבר כי בידוד כמויות מספיקות של קייסי קיימא מ רקמה זו יכולה להיות קשה מהסיבות הבאות: ראשית, העור הגבי בוגר בשלב המנוחה של מחזור השיער (טלוגן) מורכב רזה עם רק 1-2 שכבות של תאים, המוביל תשואה תא נמוך הפרדה יעילה של האפידרמיס מן הדרמיס, המהווה את השלב הקריטי לבידוד KC מוצלח. שנית, צפיפות זקיקי השיער הגבוהה הקיימת על עור הגב הבוגר תורמת עוד יותר לקושי בהפרדת האפידרמיס מהדרמיס. במקום זאת, אנו משתמשים באופן שגרתי בעור הזנב כמקור למקלטי עכבר בוגרים כמו אפיתל זה הוא עבה עם 3-5 שכבות של KCs האפידרמיס. כמו כן, יש צפיפות זקיקי השיער התחתונה, אשר אינו מפריע ההפרדה האפידרמיס, ובכך המאפשר בידוד KC מכל זנב העכבר העכבר הבוגר ללא קשר לגיל ואת שלב רכיבה על השיער של העכבר. הניאונה המבודדתKCs טל הם seeded כדי מנות מצופה ג 'לטין תרבות, ואילו קולגן מצופה מנות משמשים זרע מבוגר KCs מבוגר בשל יכולת לקויה של התאים הבוגרים לדבוק לעומת עמיתים הילודים שלהם. לתרבית KS של עכבר תרבותית, בינוני נמוך של סידן בסלמי הוא בתוספת dGS, המכיל גורם לגדילה באפידרמיס (EGF), העברת שור, גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGF1), פרוסטגלנדין E2 (PGE2), אלבומין בסרום של שורש (BSA) והידרוקורטיזון. בין 2-4 ימים לאחר ציפוי הראשוני, רוב KCs מובחן ניתן לשטוף משם במהלך שינויים יומיים יומיים, ואת התאים חסיד הנותרים להראות מורפולוגיה מרוצף טיפוסי 4 , הם מתרבים, ואינם מבטאים את סמן K10 מוקדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
האפידרמיס העור משמש כמכשול קריטי להפריד ולהגן על הגוף מפני הסביבה החיצונית ופגיעה מאובדן מים, פתוגנים, חום וקרינה אולטרה סגולה. KCs הם השושלת התא השלטת של האפידרמיס, התרבות העיקרית של KCs האפידרמיס הוא כלי שימושי ללמוד ולהבין את התהליכים הביולוגיים של היווצרות המכשול ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארתריטיס ו MUSCULOSKELETAL ו מחלת עור מענק (R01AR069653 כדי ג 'אנג LJ), ואת המכונים הלאומיים לבריאות תמיכה (5T32AR062496-03 ל CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).
