नवजात और वयस्क माउस त्वचा से प्राथमिक माउस केराटिनोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति
Summary
एपिडर्मल केरैटिनोसाइट्स एक कार्यात्मक त्वचा बाधा का निर्माण करते हैं और बाहरी पर्यावरणीय अपमान के खिलाफ मेजबान रक्षा की अगली पंक्ति पर तैनात हैं। यहाँ हम नवजात और वयस्क माउस त्वचा से एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स के अलगाव और प्राथमिक संस्कृति के तरीकों का वर्णन करते हैं, और टर्मिनल भेदभाव और यूवीबी द्वारा ट्रिगर किए जाने वाले कारेतिनोसाइट्स से भड़काऊ प्रतिक्रिया का आदान प्रदान करते हैं।
Abstract
केराटिनोसाइट (केसी) एपिडर्मिस में प्रमुख सेल प्रकार है, त्वचा की सबसे बाहरी परत। एपिडर्मल केसीएस पर्यावरण अपमान, जैसे कि यूवीबी विकिरण या रोगजनकों के खिलाफ एक अखंड त्वचा बाधा बनाने, और उन अपमानों पर एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करके त्वचा की रक्षा प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहाँ हम नवजात माउस त्वचा से और वयस्क माउस पूंछ त्वचा से केसी को अलग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। हम चेलेक्सित भ्रूण गोजातीय सीरम (सीएफबीएस) की तुलना में परिभाषित विकास की खुराक (डीजीएस) का उपयोग करते हुए कल्चरिंग शर्तों का भी वर्णन करते हैं। कार्यात्मक रूप से, हम यह दिखाते हैं कि दोनों नवजात और वयस्क केसी उच्च कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव, तंग जंक्शन गठन और स्तरीकरण के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं। इसके अतिरिक्त, सुसंस्कृत वयस्क केसी, यूवीबी-ट्रिगर सेल की मृत्यु के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और यूवीबी विकिरण पर बड़ी मात्रा में टीएनएफ जारी कर सकते हैं। साथ में, यहां वर्णित विधियां इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगीएस नवजात माउस और / या वयस्क माउस में एपिडर्मल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए
Introduction
त्वचा शरीर में सबसे बड़ा अंग है जो बाहरी सबसे परत के रूप में एपिडर्मिस के साथ है। एपिडर्मिस पर्यावरण से शरीर को अलग करने के लिए एक अखंड एपिडर्मल बाधा बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इस तरह पानी के नुकसान को रोकता है और पर्यावरणीय अपमान, जैसे एलर्जी, रोगजनकों और यूवीबी एक्सपोजर से सुरक्षा प्रदान करता है। एपिडर्मिस, एक बेसिल परत से मिलकर बहु-स्तरीकृत स्टेरेटिफाइड एपिथेलियम में एक विशिष्ट परत के रूप में विकसित होती है, जिसके बाद स्पीनस लेयर, दानेदार परत, और स्ट्रेटम कॉर्नएम होता है। बेसल केसी, दोनों एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं और ट्रांजिट-एम्पलींग कोशिकाओं से मिलकर होते हैं, प्रोलिफायरेटिव और एडिटिफाइनेटेड हैं। चूंकि बेसल केसी बाहर सेल चक्र से बाहर निकलते हैं, कोशिकाओं को भेदभाव करने के लिए प्रतिबद्धता होती है और धीरे-धीरे एपिडर्मिस की सतह की ओर बढ़ जाती है, साथ में सेल सेल जंक्शनों की परिपक्वता और एपिडर्मल पारगम्यता बाधा (ईपीबी) के गठन के साथ। स्पिनस लेयर पर केसीएस शीघ्र ही अलग-अलग तरीके से पेश करते हैंआयन मार्कर जैसे किराटिन 10 (के 10); केसी के रूप में कणिकाय परत पर विस्थापित हो जाते हैं, कोशिकाएं फिलैगग्रिन (एफएलजी), लॉरिक्रिन (एलओआर) और इनग्लोक्रिन (आईएनवी) जैसे देर से भिन्नता वाले मार्करों को व्यक्त करती हैं। स्ट्रेटम कॉर्नियम में, केसी को कॉर्नोइसाइट्स के रूप में अलग-अलग विभेदित किया जाता है, जिसे अंततः डिस्क्मेमेंट के माध्यम से बहाया जाता है क्योंकि नई कोशिकाओं की जगह उन्हें बदल दिया जाता है।
कैल्शियम को एपिडर्मिस में सबसे अधिक शारीरिक एजेंट माना जाता है और इसी तरह से इन विट्रो और विवो में भेद पैदा करता है। सामान्य त्वचा एपिडर्मिस में, कैल्शियम आयन एक विशेषता "एकाग्रता ढाल" बनाते हैं, त्वचा की सतह 1 , 2 , 3 की ओर एकाग्रता में बढ़ रही है। कैल्शियम की एकाग्रता ऊपरी दानेदार परत में एक शिखर पर सबसे कम निम्न स्तरों (बेसल और स्पीनस परत) में कम स्तर से उगता है और फिर सबसे सतही परत (स्ट्रेटम कॉर्नएम) में नगण्य स्तर तक चला जाता है। कैल्शियम ढाल भी एक घटक पारगम्यता बाधा के उद्भव के साथ संयोग से विकसित होता है, जो कि कैल्शियम सिग्नलिंग का समर्थन करता है, केसी भेदभाव की एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इन विट्रो में , कम कैल्शियम (0.02-0.1 मिमी) एक मोनोलायर के रूप में बेसल केसी के प्रसार को बनाए रखता है, जबकि उच्च कैल्शियम (> 0.1 मिमी) तंग-जंक्शन निर्माण और प्रेरण द्वारा प्रदर्शित किया गया टर्मिनल भेदभाव के लिए कोशिकाओं की एक तेज़ और अपरिवर्तनीय प्रतिबद्धता को प्रेरित करता है बेसल केसी 4 , 5 के लिए उच्च कैल्शियम उपचार पर LOR और INV का
बाधा बनाने के अलावा, एपिडर्मल केसी भी त्वचा की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण घटक है। यूवीबी विकिरण या चोट पर जारी रोगज़नक़ों या क्षतिग्रस्त-जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी) के जवाब में, केसी बहुत अधिक मात्रा में भड़काऊ साइटोकिन्स उत्पन्न कर सकते हैं, जैसे कि टीएनएफए, आईएल 6 और आईएफएनबी, जिससे प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण होती है> 6 , 7 , 8 , 9 यद्यपि केसी से उचित भड़काऊ संकेत को रोगजनन निकासी के लिए जरूरी है, अनियंत्रित भड़काऊ प्रतिक्रिया, ऑटो-सूजनयुक्त त्वचा रोगों जैसे कि छालरोग और रोसेएशिया 6 , 8 के विकास को गति दे सकती है।
कुल मिलाकर, के.सी. अक्षय त्वचा बाधा को बनाए रखने और रोगज़नक़ों के आक्रमण या पर्यावरण अपमान पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसलिए, epidermal केसी की प्राथमिक संस्कृति उपकला जीव विज्ञान, केसी भेदभाव के अध्ययन के लिए एक उपयोगी तकनीक है, साथ ही साथ केसी प्रेरित उत्तेजित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं। प्राथमिक माउस एपिडर्मल केसी की अलगाव और संस्कृति केसी की संवेदनशीलता और विभिन्न बाहरी उत्तेजक को संवेदनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया हो सकती है। यहां हम एक नवप्रवर्तित माउस त्वचा से या तो अलग-अलग केसी को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैंवयस्क माउस पूंछ त्वचा वयस्क केसी अलगाव के लिए, हम माउस पृष्ठीय त्वचा का उपयोग नहीं करते क्योंकि इस ऊतक से पर्याप्त मात्रा में व्यवहार्य केसी को अलग करना निम्नलिखित कारणों से कठिन हो सकता है: सबसे पहले, बाल चक्र (टेलोजेन) के आराम चरण में प्रौढ़ पृष्ठीय त्वचा के होते हैं कोशिकाओं के केवल 1-2 परतों के साथ पतली एपिडर्मिस, जिससे कम सेल उपज और अपरिवर्तक की अपर्याप्तता पृथक होती है, जो कि केसी अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम है। दूसरा, ऊतक बाल कूप घनत्व जो वयस्क पृष्ठीय त्वचा पर मौजूद है, उससे आगे त्वचा से एपिडर्मिस को अलग करने में कठिनाई का योगदान होता है। इसके बजाय, हम पूंछ त्वचा को वयस्क माउस केसी के स्रोत के रूप में नियमित रूप से इस्तेमाल करते हैं क्योंकि इस एपिथेलियम एपिडर्मल केसी के 3-5 परतों के साथ मोटा है। यह भी एक छोटे बाल कूप घनत्व है, जो एपिडर्मल जुदाई में हस्तक्षेप नहीं करता है, इस प्रकार माउस की उम्र और बाल साइक्लिंग चरण की परवाह किए बिना किसी भी वयस्क माउस पूंछ त्वचा से केसी अलगाव की अनुमति देता है। पृथक नियोनतालक केसी को जिलेटिन-लेपित संस्कृति व्यंजन के लिए वरीयता दी जाती है, जबकि कोलेजन-लेपित डिश का उपयोग वयस्कों के अलग-अलग केसी के लिए किया जाता है क्योंकि उनके नवजात समकक्षों की तुलना में वयस्क कोशिकाओं का पालन करने की अक्षमता की क्षमता होती है। संस्कृति माउस केसीएस के लिए, कम कैल्शियम बेसल माध्यम डीजीएस से पूरक होता है, जिसमें एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), बोवाइन ट्रांसफिरिन, इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक सी 1 (आईजीएफ 1), प्रोस्टाग्लैंडीन ई 2 (पीजीई 2), गोजाइन सीरम एल्बूमिन (बीएसए) और हाइड्रोकार्टेसोन शामिल हैं। प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 2-4 दिनों के बीच, विभिन्न माध्यमिक परिवर्तनों के दौरान अधिकांश अलग-अलग केसीओं को धोया जा सकता है, और शेष अनुयायी कोशिकाएं आम तौर पर cobblestone morphology दिखाती हैं 4 , विस्तार कर रही हैं, और प्रारंभिक भेदभाव मार्कर K10 को व्यक्त नहीं करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
बाहरी वातावरण से शरीर को अलग करने और शरीर को बचाने, पानी के नुकसान, रोगजनकों, गर्मी और यूवी विकिरण से अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में त्वचा एपिडर्मिस कार्य। के सी एस एपिडर्मिस की प्रमुख सेल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय संस्थानों के आर्थथिटिस और मस्कुलोस्केलेलेट और त्वचा रोग अनुदान (झांग एलजे के लिए R01AR069653), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य सहायता संस्थान (सीए के लिए 5T32AR062496-03) द्वारा समर्थित था।
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
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