Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti
Summary
I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.
Abstract
Il keratinocyte (KC) è il tipo di cellula predominante nell'epidermide, lo strato più esterno della pelle. I KC epidermici svolgono un ruolo fondamentale nel fornire la difesa della pelle, formando una barriera cutanea intatta contro gli insulti ambientali, come l'irradiazione UVB o gli agenti patogeni e anche avviando una risposta infiammatoria su tali insulti. Qui descriviamo metodi per isolare i KC dalla cute del neonato e dalla pelle adulta di coda del mouse. Descriviamo anche le condizioni di coltura usando gli integratori di crescita definiti (dGS) in confronto al siero bovino fetale chelexed (cFBS). Funzionalmente, dimostriamo che sia KC neonatali che adulti sono altamente reattivi per l'alta calcio-indotta della differenziazione dei terminali, alla stretta formazione di giunzione e stratificazione. Inoltre, i KC adulti coltivati sono suscettibili di morte cellulare causata da UVB e possono rilasciare grandi quantità di TNF dopo l'irraggiamento UVB. Insieme, i metodi qui descritti saranno utili ai ricercatori per la messa a punto del modello in vitroS per studiare la biologia epidermica nel mouse neonatale e / o nel mouse adulto.
Introduction
La pelle è l'organo più grande del corpo con l'epidermide come lo strato più esterno. L'epidermide svolge un ruolo fondamentale nella formazione di una barriera epidermica intatta per separare il corpo dall'ambiente, impedendo così la perdita di acqua e protegge dagli insulti ambientali, come gli allergeni, gli agenti patogeni e l'esposizione UVB. L'epidermide si sviluppa da un unico strato di cheratinociti basali (KCs) indifferenziati in un epitelio stratificato multistrato costituito da uno strato basale seguito da uno strato spinoso, uno strato granulare e uno strato corneo. I KC basali, costituiti da cellule staminali epidermiche e cellule di transito-amplificazione, sono proliferative e indifferenziate. Poiché i KC basali usciranno dal ciclo cellulare, le cellule si impegnano a differenziarsi e gradualmente migrare verso la superficie dell'epidermide, accompagnate dalla maturazione delle giunzioni delle cellule cellulari e alla formazione di una barriera permeabilità epidermica (EPB). I KC nello strato spinoso esprimono la differenziazione precoceMarcatori ioni come Keratin 10 (K10); Mentre i KC migrano allo strato granulare, le cellule esprimono marcatori di differenziazione tardiva come Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). Allo strato corneo, i KCs diventano terminali corneociti differenziati, che vengono infine sparati attraverso la desquamazione quando le nuove cellule li sostituiscono.
Il calcio è considerato l'agente più fisiologico nell'epidermide e provoca la differenziazione in vitro e in vivo in modo simile. Nell'epidermide della pelle normale, gli ioni di calcio formano un caratteristico "gradiente di concentrazione", aumentando la concentrazione verso la superficie della pelle 1 , 2 , 3 . La concentrazione di calcio sale da bassi livelli nei sottosuperfici più bassi (basi e spinosi) ad un picco dello strato granulare superiore e poi scende a livelli trascurabili nello strato più superficiale (strato corneo). Il gradiente di calcio si sviluppa coincidente anche con l'emergere di una barriera di permeabilità del componente, che sostiene che la segnalazione di calcio svolge un ruolo fondamentale della differenziazione del KC. In vitro , il basso contenuto di calcio (0,02-0,1 mM) mantiene la proliferazione dei KC basali come monostrato, mentre alto contenuto di calcio (> 0,1 mM) induce un impegno rapido e irreversibile delle cellule alla differenziazione dei terminali come dimostrato dalla formazione di stretti giunti e dall'induzione Di LOR e INV su un trattamento di calcio alto ai KC basali 4 , 5 .
Oltre alla formazione di barriera, i KC epidermici sono anche una componente importante del sistema immunitario innato della pelle. In risposta agli agenti patogeni o agli schemi molecolari associati danneggiati (DAMP) rilasciati all'irraggiamento o lesioni UVB, i KCs possono produrre grandi quantità di citochine infiammatorie, quali TNFα, IL6 e IFNβ, che portano all'attivazione del sistema immunitario> 6 , 7 , 8 , 9 . Sebbene sia necessaria una corretta indicazione infiammatoria da KC per la clearance del patogeno, la risposta infiammatoria incontrollata può innescare lo sviluppo di malattie cutanee auto-infiammatorie, come la psoriasi e la rosacea 6 , 8 .
Nel complesso, i KC svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere la barriera cutanea intatta e iniziare una risposta immunitaria su invasione degli agenti patogeni o insulti ambientali. Pertanto, la cultura primaria di KC epidermici è una tecnica utile per studiare la biologia epiteliale, la differenziazione del KC, così come le risposte immunitarie innate di KC. L'isolamento e la cultura di KC epidermici del mouse primario possono essere un processo impegnativo dovuto alla suscettibilità e alla sensibilità di KC a vari stimolanti esterni. Qui descriviamo un metodo per isolare e coltivare KC da una pelle al neonato o da un topoPelle adulta della coda del mouse. Per l'isolamento adulto di KC non usiamo la pelle dorsale del mouse perché isolare quantità sufficienti di KC vitali da questo tessuto può essere difficile per i seguenti motivi: In primo luogo, la pelle dorsale adulta alla fase di riposo del ciclo dei capelli (telogen) è costituita da un Sottile epidermide con solo 1-2 strati di cellule, portando ad un rendimento a bassa cella e alla separazione inefficiente dell'epidermide dal derma, che è il passo fondamentale per l'isolamento di successo di KC. In secondo luogo, l'elevata densità dei follicoli dei capelli presenti sulla pelle dorsale adulta contribuisce ulteriormente alla difficoltà di separare l'epidermide dal derma. Al contrario, utilizziamo abitualmente la pelle della coda come sorgente per i topi adulti del KC, poiché questo epitelio è più spesso con 3-5 strati di KC epidermici. Ha anche una densità inferiore dei follicoli dei capelli, che non interferisce con la separazione epidermica, consentendo quindi l'isolamento di KC da qualsiasi pelle adulta del cervello per adulti, indipendentemente dall'età e dalla fase di ciclismo dei capelli del mouse. La neona isolataTal KCs vengono seminati a piatti di coltura rivestiti in gelatina, mentre i piatti rivestiti con collagene vengono impiegati per seminare KC adulti isolati a causa della capacità compromessa delle cellule adulte ad aderire rispetto alle loro controparti neonatali. Per la coltivazione del KCs del topo, il medium basico a basso contenuto di calcio è integrato con dGS, che contiene il fattore di crescita epidermico (EGF), il transferrin bovino, il fattore di crescita di insulina-like (IGF1), il prostaglandina E2 (PGE2), l'albumina del siero bovino (BSA) e l'idrocortisone. Tra 2-4 giorni dopo la placcatura iniziale, la maggior parte dei KC differenziati può essere lavata durante i cambiamenti medi giornalieri e le restanti cellule aderenti mostrano la tipica morbologia dei ciottoli 4 , si proliferano e non esprimono il marker di differenziazione precoce K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'epidermide della pelle funziona come una barriera critica per separare e proteggere il corpo dall'ambiente esterno e danneggiare la perdita di acqua, gli agenti patogeni, il calore e l'irradiazione UV. I KC sono la linea di cellule predominante dell'epidermide e la coltura primaria dei KC epidermici è uno strumento utile per studiare e comprendere i processi biologici della formazione delle barriere e la risposta di KC a insulti ambientali in vitro .
Qui descrivia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall'UNITATIVO NAZIONALE DI ARTHRITIS e MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES (R01AR069653 a Zhang LJ) e presso gli Istituti Nazionali di Sostegno alla Salute (5T32AR062496-03 a CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
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