Summary

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017
doi:

Summary

Yüksek yağlı diyet beslenme obezite Drosophila, anlayış temel moleküler mekanizmalar içinde lipotoxicity karıştığı için bir model olarak ikna etmek için iletişim kuralı bu. Ayrıca yüksek işlem hacmi triacylglyceride tahlil Drosophila ve potansiyel olarak diğer (böcek) modelleri çeşitli diyet, çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ birikimi ölçmek için sağlar.

Abstract

Kalp hastalığı insan ölüm dünya çapında bir numaralı nedenidir. Çok sayıda çalışmalar insanlarda güçlü bağlantıları arasında obezite ve kalp arıza göstermiştir ama daha fazla araç ve araştırma çabalarını daha iyi mekanizmaları dahil aydınlatmak için ihtiyaç vardır. İçin bir yüzyılı aşkın süredir, Drosophila genetik olarak son derece uysal modelinin anahtar genlerin ve türler arasında son derece korunmuş kanıtladı moleküler yollar keşfi vesile olmuştur. Birçok biyolojik süreçlerin ve hastalık mekanizmaları işlevsel olarak geliştirme (örneğin, vücut planı, kalp), kanser ve nörodejeneratif hastalık gibi anında korunmuş. Son zamanlarda, obezite ve model organizmalar, kalp hastalığı gibi ikincil patolojiler çalışma anahtar düzenleyiciler metabolik Sendromu insanlarda dahil tanımlama son derece kritik bir rol oynamıştır.

Burada, neden obezite, Yani, aşırı yağ birikimi ve yağ içeriği Etiketler birikimi şeklinde izlemek için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek için etkili bir araç olarak bu model organizma kullanmayı öneriyorum. Ek olarak son derece korunmuş, ancak daha az karmaşık genom, anında da hızlı deneme, maliyet-etkililik ile kombine için kısa bir ömrü vardır. Bu inceleme obezite ve yağ içeriği yüksek tekrarlanabilir olmak amacı ile ilişkili artış ölçmek için bir yüksek üretilen iş triacylglyceride (TAG) tahlil ikna etmek için Drosophila yüksek yağlı diyet (HFD) beslenme için detaylı bir protokol sağlar ve büyük ölçekli genetik veya kimyasal tarama için etkili. Bu protokoller verimli düzenleyici mekanizmaları obezite ilgili araştırmak, aynı zamanda ilaç bulma araştırma geliştirme ilaç adaylarının etkisinin hızlı test etmek için standart bir platform sağlamak için yeni fırsatlar sunmak veya Obezite, diyabet ve ilgili metabolik hastalıkları önleme.

Introduction

Biz bir zaman obezite ve onun ilişkili ekonomik güçlükler, nerede bir dünya çapında sorun1vardır. İki her üç Amerikalı dışında fazla kilolu ya da obez ilgili kalp patolojiler, ölüm2yetişkin nüfus içinde birincil nedeni ile vardır. Yeni verimli yöntemleri yeterince metabolik sendrom model organizmalar kullanarak yönetmelikte karıştığı genetik ve moleküler bileşenleri araştırmaya ihtiyaç vardır. 3,4,5,6fareler ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerin ile en temel biyolojik süreçlerin hisse çünkü bu nedenle, biz meyve sineği Drosophila modeli seçin. Drosophila‘ ın genom son derece korunmuş evrim sırasında ama genel olarak çok daha küçük daha az gen ikilenmesi ve metabolik karmaşıklığı, birçok insan hastalıkları4 ‘ te karıştığı temel mekanizmaları anlamak için idealdir , 7 , 8. Ayrıca, karakteristik süreçleri yağ dokusu, gut tarafından yürütülen ve pankreas sinek içinde gösterilir ve insanlar9‘ a, benzer olan düzenleyici işlevleri glikoz ve lipid metabolizması, örneğin, aracılık 10,11. Ayrıca, temel moleküler yolları obezite, insülin direnci ve insanlarda diyabet kontrol dahil işlevsel olarak Drosophila melanogaster12,13,14 ‘ te konservasyonu , 15 , 16. daha yüksek organizmalar gibi Drosophila geliştirme sırasında memeli kalp3,17‘ e benzer işlemler tarafından kurulmuş bir kalbi vardır. Böylece, besleme protokolü ve yüksek işlem hacmi etiket tahlil, Drosophila, genetik araç kutusunu kullanarak verimli tarama amaçlı adapte güvenilir bir HFD gelişimi sağlayan çalışma ve temel genetik temeli anlamak için önemli bir araç temel karmaşık metabolik hastalıklar.

HFD yemek ile Hindistan cevizi yağı, çoğunlukla doymuş yağ asitlerinin metabolik sendrom18ile ilişkili olduğu bilinen oluşan takıma bir standart laboratuvar sinek yemek yapılır. Obezite gibi kemirgenler, memeli modellerinde inducing, ay19,20alırken, bizim en iyi duruma getirilmiş HFD Protokolü besleme Drosophila içinde etkili ve tekrarlanarak birkaç içinde organizma yağ içeriği artar gün12,14. Bu iletişim kuralı, bir yüksek işlem hacmi etiket tahlil ile birlikte genetik faktörler, çevresel etkilere ve yağ metabolizmasının yeni modülatörler keşfetmek için ilaç adaylarının etkileri için verimli kitle tarama sağlar. Sonuç olarak, bu protokoller olasılığı anlamak ve/veya insan patolojiler obezite ile ilişkili ve obezite ile mücadele ilgili.

Besleme protokolü çok yönlü ve tek doymuş veya doymamış yağ asidi metabolik ve fonksiyonel etkilerini incelemek için uygulanabilir. Bu yüksek işlem hacmi etiket tahlil kullanımını D. melanogasteriçin sınırlı değildir, ancak küçük model organizmalar kütikül veya zor ekstraselüler matrisler (örneğin, diğer Drosophila türler, C. elegans ile çeşitli adapte ve diğer omurgasız canlılar gelişmekte olan) farklı çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ içeriği geliştirme, yetişkinlik veya metabolik hastalık aşaması herhangi bir aşamasında ölçmek için. ETİKET tahlil Renkölçer ölçüm etiketleri içine serbest yağ asitleri, gliserol, gliserol 3-fosfat ve sonunda H2O2 4-aminoantipirin (4-AAP) ve 3,5 – ile tepki veren aşağılamak enzimatik reaksiyonlar bir dizi dayanmaktadır dichloro-2-hydroxybenzene Sülfonat (96-şey Spektrofotometre ölçülür bir kırmızı renkli ürün üretmek için 3,5 DHBS).

Protocol

1. protokol besleme HFD Tablo 1. Sinek yemek tarifi. Bu tablo farklı malzemeler bizim kontrolümüz yemek hazırlamak için kullanılan özetler. Bir kez, gıda 10 mL tüpler dökülür, soğutmalı ve uzun süreli depolama için 4 ° C’de depolanan. HFD hazırlık 1 kg yüksek yağ yemek yapmak için önceden yapılmış normal sinek gıda 700 g tartmak (bkz. …

Representative Results

D. melanogasteriçinde diğer türler ile olduğu gibi işte cinsel dimorfizm kadın ve erkek22arasında. İyi kadınlar daha büyük, onların abdomens daha fazla yağ daha erkek22ile bilinmektedir. Bizim iletişim kuralı etkinliğini test etmek için etiket deneyleri Etiketinin içeriği standart laboratuvar wildtype (w1118) kadınlar ve erkekler arasındaki farklılıkları uçar belirlemek için gerçekleşt…

Discussion

Obezite indüksiyon farelerde ay19,20alabilir. Sinekli, aşırı yağ birikimi bir kaç gün veya daha az, (bkz: Şekil 2) sadece 18 s sonra yağ birikimi artar neden indüksiyon Protokolü besleme bu HFD sağlar. Açıklanan protokolü ile besleme HFD glikoz içerik 12 artırır ve Bmm lipaz ve PGC-1 ifade24azaltır. Bu yağ ve şekeri içeriği25,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Erika Taylor bu el yazması düzenleme için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser S.B.D. Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01 HL098053, P01 AG033561 ve R01 HL054732) R.B. için bir doktora sonrası araştırma ek (R01 HL085481) ve arkadaş grubu (AAUW) hibe ve S.B.D. Amerikan Kalp Derneği’nden hibe tarafından finanse edildi ve R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

References

  1. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  2. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
  3. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
  4. Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
  5. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
  6. Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
  7. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  8. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  9. Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
  10. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
  11. Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
  12. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
  13. Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
  14. Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
  15. Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
  16. Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
  17. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  18. Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
  19. Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
  20. Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
  21. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
  22. Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. 유전학. 205, 1215-1228 (2017).
  23. Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
  24. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
  25. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
  26. Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
  27. Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
  28. Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
  29. Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
  30. Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
  31. Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).

Play Video

Cite This Article
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

View Video