Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und<em> CMAH</em> Knock-out Mäuse.
Summary
Wir beschreiben ein HPLC-basiertes Verfahren zur Bestimmung von N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylenuraminsäure in Mausleber und Milch.
Abstract
CMAH (Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure-hydroxylase) ist verantwortlich für die Oxidation von Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäuren bei Säugetieren. Jedoch kann der Mensch Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure nicht zu Cytidinmonophosphat-N-glykolylneuraminsäure aufgrund einer primären Exon-Deletion des CMAH- Gens oxidieren. Um die Effekte und Implikationen des Mangels an CMAH-Aktivität genauer zu verstehen, ist ein Cmah- Knock-out-Modell bei Mäusen von großem Interesse an Grund- und angewandter Forschung. Das Analyseverfahren zur Bestimmung des Phänotyps dieses Mausmodells wird hier im Detail beschrieben und basiert auf dem Nachweis sowohl der N-Acetylneuraminsäure als auch der N-Glykolylenuraminsäure in der Leber und der Milch von Wildtyp- und Cmah- Knock-out-Mäusen. Endogene Sialinsäuren werden freigesetzt und mit o-Phenylendiamin derivatisiert, um fluorogene Derivate zu erzeugen, die anschließend mittels HPLC analysiert werden können. Das vorgestellte Protokoll kann seinAuch für die Analyse von Milch und Gewebeproben aus verschiedenen anderen Ursprüngen angewendet und kann von Nutzen sein, um die ernährungs- und gesundheitlichen Auswirkungen von N-Glykolylneuraminsäure zu untersuchen.
Introduction
N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und N-Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc) sind die häufigsten Sialinsäuren bei den meisten Säugetieren 1 . Obwohl es in der Lage ist, Neu5Ac endogen zu synthetisieren, sind die Menschen nicht in der Lage, Neu5Gc aufgrund einer primären Exon-Deletion auf dem CMAH- Gen, das für eine CMP-Neu5Ac-Hydroxylase 2 , 3 kodiert , zu produzieren . Allerdings können tierische Lebensmittelprodukte diätetische Quellen von Neu5Gc 4 , 5 , 6 sein , was zur Herstellung von Anti-Neu5Gc-Antikörpern führt und daher eine Immunantwort gegen Neu5Gc 7 auslöst. Diese diätetische Wirkung von Neu5Gc wird vermutlich zur chronischen Entzündung und verschiedenen anderen Krankheiten beitragen 8 , 9 , 10 . Um die Wirkungen von Neu5Gc in h zu verstehenUmans, ein Tiermodell für die systematische Untersuchung der Wirkungen von lebensmittelhaltigen Sialinsäuren ist höchst wünschenswert. Obwohl die auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Protokolle zur Analyse von Knock-out-Mäusen gut etabliert sind und ein bequemer Weg für die genotypische Beurteilung ist, erfordert die funktionelle Analyse des Phänotyps auf dem metabolischen Niveau spezifischere Analysemethoden. Der Phänotyp eines Cmah- Knock-out-Mausmodells kann durch Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Sialinsäuren in Leber- oder Milchproben beurteilt werden. Mehrere Verfahren zum Nachweis von Sialinsäuren in tierischen Geweben wurden bisher beschrieben: Die Umsetzung von Sialinsäuren mit Resorcin 11 oder Thiobarbitursäure 12 führt zur Bildung eines chromophoren Produktes und kann einfach unter Verwendung eines plateraderbasierten Aufbaus analysiert werden, aber nur das gesamte Sialis Säuregehalt kann bestimmt werden. Alternativ wurde auch die Analyse von Sialinsäuren mittels Gaschromatographie beschrieben13 , MALDI-ToF-Massenspektrometrie 14 oder amperometrische Methoden 15 . Die am häufigsten angewandten Sialinsäureanalyseverfahren basieren jedoch auf der hydrolytischen Freisetzung, gefolgt von der Fluoreszenzderivatisierung und der nachfolgenden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll erlaubt die phänotypische Beurteilung von homozygoten Cmah- Knock-out-Mäusen durch Analysieren und Quantifizieren der relativen Mengen an Neu5Gc Milch und Leberproben. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Standard-HPLC-Setups mit Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Herstellung der Anionenaustauschsäulen und die Durchführung der Anionenaustauschchromatographie; Um das Harz richtig zu regeln und die richtigen Wasch- und Eluti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil von der Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Zuschussnummern 31471703, A0201300537 und 31671854 an JV und LL) und dem 100 Foreign Talents Plan (Zuschussnummer JSB2014012 an JV) unterstützt.
Materials
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. +3)-+and+alpha(2+–>+6)-isomers.”>Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 –> 3)- and alpha(2 –> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
