Мы описываем метод ВЭЖХ для определения N-ацетилнейраминовой кислоты и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мыши.
CMAH (гидроксилаза цитидин-моно-фосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты) ответственна за окисление монофосфат-цитидин-N-ацетилнейраминовых кислот у млекопитающих. Однако люди не могут окислять монофосфат-N-ацетилнейраминовую кислоту цитидина до монофосфат-N-гликолинераминовой кислоты цитидина из-за первичной экзоновой делеции гена CMAH . Чтобы более подробно понять последствия и последствия отсутствия активности CMAH , модель нокаутов Cmah у мышей представляет большой интерес к фундаментальным и прикладным исследованиям. Метод анализа для определения фенотипа этой модели мыши подробно описан здесь и основан на обнаружении как N-ацетилнейраминовой кислоты, так и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мышей с диким типом и Cmah . Эндогенные сиаловые кислоты высвобождаются и дериватизируются о-фенилендиамином для получения флуорогенных производных, которые затем могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ. Представленный протокол может бытьТакже применяется для анализа образцов молока и тканей из различных других источников и может быть полезен для исследования пищевых и медицинских эффектов N-гликолилнейраминовой кислоты.
N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и N-гликолилнеураминовая кислота (Neu5Gc) являются наиболее распространенными сиаловыми кислотами у большинства млекопитающих 1 . Несмотря на то, что эндогенно синтезируется Neu5Ac, люди не способны продуцировать Neu5Gc из-за первичной делеции экзона на ген CMAH , кодирующий гидроксилазу CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Однако пищевые продукты на основе животных могут быть диетическими источниками Neu5Gc 4 , 5 , 6 , что приводит к получению антител против Neu5Gc и, следовательно, вызывает иммунный ответ на Neu5Gc 7 . Предполагается, что этот диетический эффект Neu5Gc способствует хроническому воспалению и различным другим заболеваниям 8 , 9 , 10 . Чтобы всесторонне понять эффекты Neu5Gc в hUmans, животная модель для систематического изучения эффектов сиаловых кислот пищевого происхождения весьма желательна. Хотя протоколы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа выбитых мышей, хорошо известны и являются удобным способом генотипической оценки, функциональный анализ фенотипа на метаболическом уровне требует более конкретных методов анализа. Фенотип модели выкатной мыши Cmah можно оценить, выделив и проанализировав состав сиаловых кислот в образцах печени или молока. Ранее сообщалось о нескольких методах обнаружения сиаловых кислот в тканях животных: реакция сиаловых кислот с резорцинолом 11 или тиобарбитуровой кислотой 12 приводит к образованию хромофорного продукта и может быть просто проанализирована с использованием установки на основе плиттера, но только общая сиалическая Содержание кислоты может быть определено. Альтернативно, анализ сиаловых кислот также описывался с использованием газовой хроматографии13 , масс-спектрометрия MALDI-TOF 14 или амперометрические методы 15 . Однако наиболее часто применяемые методы анализа сиаловой кислоты основаны на гидролитическом высвобождении с последующей дериватизацией флуоресценции и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией 16 , 17 , 18 .
Представленный здесь протокол позволяет фенотипическую оценку гомозиготных мышечных мышей Cmah , анализируя и количественно определяя относительные количества Neu5Gc образцов молока и печени. Анализ проводили с использованием стандартной установки ВЭЖХ с детектированием флуо…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (номера грантов 31471703, A0201300537 и 31671854 для СП и LL) и 100 иностранных планов талантов (номер гранта JSB2014012 для СП).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |