라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.
대뇌 피 질 개발, 조상 세포 새로운 창시자 또는 postmitotic 신경 생성 하 대칭 및 비대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다. 나중에, 일부 창시자 gliogenic 운명에 사이토와 oligodendrocyte 인구에 추가 전환 합니다. 기본 대뇌 피 질 세포 배양의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 세포 분열의 모드와 조상 세포의 세포 주기 매개 변수 제어 세포 및 분자 메커니즘 연구 가능 하다. 마찬가지로, postmitotic 세포의 운명은 셀 전용 형광 기자 단백질을 사용 하 여 또는 포스트 immunocytochemistry 이미징 시험 될 수 있다. 더 중요 한 것은, 이러한 기능을 모든 종류의 특정 세포 생성 하기 위해 노력 하는 창시자의 식별 수 있도록 단일 세포 수준에서 분석할 수 있습니다. 유전자 발현의 조작 또한 바이러스 중재 transfection, 세포 자치 및 셀을 자치 현상의 연구를 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 퓨전 형광 단백질의 사용 부문 및 딸 세포 운명과 상관 하는 동안 선택 된 단백질의 대칭 및 비대칭 분포의 연구를 수 있습니다. 여기, 우리는 며칠에 대 한 기본 대뇌 피 질 murine 셀을 이미지 하 여 세포 분열, 세포 주기 길이 및 새로 생성 된 셀의 운명의 모드 분석 시간 경과 비디오 현미경 방법 설명. 우리는 또한 transfect 조상 세포의 유전자를 조작 하거나 단순히 기자 단백질 셀 라벨에 적용할 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다.
신경 줄기 세포 (NSC)는 대뇌 피 질 개발 중 신경 및 macroglial 셀을 생성합니다. 초기-corticogenesis, NSCs 대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다 고 뿌리 풀 확장. 다음, NSCs 나누기 비대칭 중간체1를 통해 직접 또는 간접적으로 뉴런을 생성 합니다. 에 중반-에 늦은-corticogenesis, 창시자 이다 및 oligodendrocytes2,,34생성 하 전환 합니다. 그러나, 운명 제한 창시자 독특한 종류의 신경 또는 macroglial 세포의 생성에 기여 뿐만 아니라 세포 증식 및 분화, 제어 하는 완전 한 메커니즘 강렬한 토론4,,56의 문제가 남아 있습니다. 광범위 하 게 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서 와 같은 수많은 기법을 사용 하 여 신경, 이다 oligodendrocytes를 생성 하기 위해 개별 외피 NSCs의 잠재력 되었습니다: 단일 셀 문화7,8,9,10,11,,1213; 이미징 라이브 고밀도 문화 문화3,,1415; 이미징 라이브 라이브 이미징 슬라이스 문화16,,1718; 바이러스 성 벡터 중재 유전 라벨 고밀도 문화14,15,19,,2021;를 사용 하 여 클론 분석 클론 분석에 비보에 레트로 바이러스22,23,,2425,26,27,28,29,30,31,32,33;를 사용 하 여 그리고 클론 분석에 vivo에서 유전자 변형 동물34를 사용 하 여.
이러한 기술을 각각 장점과 단점을 제공합니다. 예를 들어, 혈통 추적 vivo에서 총괄 한 그리고 분할 오류3, 개별 외피 창시자의 잠재력에 대 한 상반 된 결론을 이끌어을 받기 쉽습니다. 또한, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문 초기 시간 포인트에서 조상 세포의 라벨에 따라 그리고 후부 분석 세포 계보의 혈통-진행35동안 세포 죽음의 들 키 지 않고 발생에 의해 영향을 수 있습니다. 따라서, 단일 NSCs의 잠재력 분석 하기 적합 한 시스템 생성 하는 모든 셀의 식별 뿐만 아니라 혈통 내에서 세포 운명의 적절 한 묘사를 허용 해야 합니다. 1 차 세포 배양 및 라이브 이미징의 조합에는이 설정을 제공합니다. 단일 세포 배양 및 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 사원 외. 스위치에에서 나타났습니다 gliogenesis11성체에서 개별 대뇌 피 질 창시자의 계보. 나중에, 그들은 뉴런의 종류는 단일 외피 조상12에서 생성 됩니다 보여 동일한 시스템을 사용. 그러나,이 시스템 중요 한 경고 표시: 4 이상의 자손9의 클론을 생성 하는 이른 corticogenesis에서 절연 외피 창시자의 1%만. FGF2 추가 후 4 명 이상 세포 생성 세포의 주파수 8-109증가 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 숫자는 너무 작은이 단계에서 거의 모든 대뇌 피 질의 창시자는 증식을 고려. 또한, 운명 사양에 FGF2의 잠재적인 효과36배제할 수 없다. 고밀도 세포 배양 (Pax6 표현) 심 실 둘 다의 확산을 지 원하는 사용이 한계를 우회 하 고 subventricular (Tbr2 표현) 대뇌 피 질의 창시자15. 또한, 이러한 문화의 실시간 관찰 NSC 혈통 진행의 여러 가지 기능 세포 분열, 세포 주기 길어, 잠재력 단일 셀의 신경 및 명과, 다른 사람의 사이에서 생성 하는 모드 등이 조건 하에서3,15재현은 보이고 있다. 최근에, 우리는 또한 사용이 시스템 그 쥐37에서 미 성숙한 대뇌 피 질 뉴런의 세포 생존에 영향을 미치는 CREB 신호 보여. 따라서, 우리가 믿는 그 시간 경과 비디오 현미경 기본 murine 대뇌 피 질의 고밀도에 성장 하는 세포는 세포 주기 진행의 세포 및 분자 메커니즘, 세포 분열, 세포 생존 및 세포 운명 명세 모드를 공부 하는 강력 하 고 액세스할 수 도구. 후자는 수행할 수 있습니다 실시간38,,3940 에 특정 세포 운명의 식별 또는 immunocytochemistry3,38,,4142후 이미징의 사용을 허용 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여.
여기, 우리는 기본 대뇌 피 질 세포 배양 지원 NSCs의 확산 및 신경 및 macroglial 세포의 다음 세대를 준비 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 또한 식별 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 단일 셀 수준에서 추적 될 수 있는 개별 세포의 유전자 발현 조작 transfection retroviral 중재의 사용 설명. 설치류에 corticogenesis의 끝에 처음부터 격리 기본 대뇌 피 질 세포를 공부 하이 프로토콜을 사용할 수 있지만 몇 가지 조정 단계14에 따라 필요할 수 있습니다. 다른 소스에서 분리 하는 NSCs 또한 공부 될 수 있다 2D 문화의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 하지만 적절 한 자란 시스템 셀 동작 생체 외에서 그리고 vivo에서38,43를 비교 하 여 결정 되어야 한다.
실시간으로 관찰 기본 대뇌 피 질 세포의 세포 증식의 분석, 세포 분열, 세포 주기 길이, 세포 분화 및 세포 생존3,14,,1537의 모드 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 신경3NSCs에서 진행 하는 동안 제정 중간 단계의 식별으로 이어지는 단일 세포 계보의 연구 허용. 마지막으로, 공학 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 CNPq (게 나시오날 드 Desenvolvimento Científico e Tecnológico), 망 (Coordenação de Aperfeiçoamento 데 피해 드 높이 등)에 의해 지원 되었다, FAPERN (Fundação de Amparo 검색 할 리오 그란데 노르 테 할).
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
Isoflurane | Sigma | 792632 | |
anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
ImageJ | NIH | ||
tTt | ETH Zurich | ||
Cell observer microscope | Zeiss | ||
Pasteur pipette | |||
PBS | |||
The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |