Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg att studera cellulära beteenden i realtid. Här beskriver vi ett protokoll för time-lapse video-mikroskopi av primära hjärnbarken celler som gör att en detaljerad granskning av de faser som antogs under härstamning progression från primära neurala stamceller till differentierade nervceller och glia.
Under hjärnbarken utveckling genomgå stamceller flera omgångar av symmetriska och asymmetriska celldelningar att generera nya föräldraparets eller postmitotic nervceller. Senare, byta några föräldraparets till ett gliogenic öde, att lägga till de astrocyt och oligodendrocyte populationerna. Med time-lapse video-mikroskopi av primära hjärnbarken cellkulturer, är det möjligt att studera de cellulära och molekylära mekanismer som styr funktionsläget av celldelning och cellcykeln parametrar av stamceller. Likaså kan ödet för postmitotic celler undersökas med hjälp av cell-specifika fluorescerande reporter proteiner eller efter imaging immuncytokemi. Viktigare, kan alla dessa funktioner analyseras på enskild cell nivå, möjliggör identifiering av föräldraparets begått till generation av specifika celltyper. Manipulation av genuttryck kan också utföras med viral-medierad transfection, möjliggör studiet av cell-självständiga och icke-cell-autonoma fenomen. Slutligen, användning av fusion fluorescerande proteiner gör studien av symmetriska och asymmetriska fördelningen av valda proteiner under avdelningen och sambandet med dottercellerna öde. Här, beskriver vi metoden time-lapse video-mikroskopi för att bilden primära hjärnbarken murina celler för upp till flera dagar och analysera läget för celldelning, cellcykelns längd och ödet av nygenererad celler. Vi beskriver också en enkel metod för att transfect stamceller, som kan tillämpas för att manipulera gener av intresse eller helt enkelt etikettera celler med reporter proteiner.
Neurala stamceller (NSC) generera nervceller och macroglial celler under hjärnbarken utveckling. På tidigt-corticogenesis, Karolina genomgå flera omgångar av symmetriska celldelning och expandera stamcellspoolen. Sedan, Karolina klyftan asymmetriskt att generera nervceller direkt eller indirekt genom intermediärer1. Endast på Växla mitten av – till sent-corticogenesis, stamfäder för att generera astrocyter och oligodendrocyter2,3,4. De fullständiga mekanismer som styr cellproliferation och differentiering, samt bidraget från öde-begränsad stamfäder till generation av unika typer av nervceller eller macroglial celler är dock en fråga om intensiv debatt4,5,6. Enskilda kortikala Karolina potential att generera nervceller, astrocyter och oligodendrocyter har varit flitigt studerade in vitro- och in-vivo med en myriad av tekniker såsom: live imaging i encelliga kulturer7,8,9,10,11,12,13. Live-imaging i hög densitet kulturer kulturer3,14,15. Live-imaging i slice kulturer16,17,18. klonal analys med viral vektor-medierad genetiska märkning i hög densitet kulturer14,15,19,20,21. klonal analys i vivo som använder retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; och klonal analys i vivo med transgena djur34.
Var och en av dessa tekniker utgör för- och nackdelar. Exempelvis är i vivo lineage tracing mottagliga till bunta och blixtra fel3, leder till motstridiga slutsatser om potentialen av enskilda kortikala stamfäder. Dessutom både in vitro och in-vivo studier utifrån märkningen av stamceller på tidiga tidpunkter och bakre analys av cell härstamningar kan påverkas av oupptäckt förekomsten av celldöd under härstamning-progression35. Därför måste ett lämpligt system att analysera potentialen för enda Karolina tillåta identifiering av alla celler genereras, samt lämpliga karakterisering av cell öden av härstamning. Kombinationen av primär cellkultur och levande imaging ger inställningen. Använda single-cell kultur och time-lapse video mikroskopi, har templet et al. visat växeln i linjen av enskilda hjärnbarken stamfäder från neurogenes till gliogenesis11. Senare, används de samma system för att visa att olika typer av nervceller genereras från en enda kortikala stamceller12. Men detta system utgör en viktig varning: endast 1% av kortikala föräldraparets isolerad på tidig corticogenesis generera kloner av 4 eller fler avkommor9. Efter tillägg av FGF2 ökar frekvensen av celler som genererar 4 eller fler celler till 8-10%9. Detta nummer är dock för liten med tanke på att nästan alla kortikala föräldraparets proliferativ i detta skede. Dessutom uteslutas inte de potentiella effekterna av FGF2 på öde-specifikation36. För att kringgå dessa begränsningar, vi använde högdensitets cellkulturer som stöder spridningen av både ventrikulära (Pax6-uttrycker) och subventrikulära (Tbr2-uttryckande) kortikala föräldraparets15. Realtid observation av dessa kulturer har dessutom visat att flera funktioner av NSC härstamning progression återges under dessa förhållanden, som funktionsläget av celldelning, förlängning av cellcykeln, enstaka celler potential att generera nervceller och glia, bland annat3,15. Mer nyligen har vi också använt detta system för att visa att CREB-signalering påverkar cellöverlevnad av omogna hjärnbarken nervceller i möss37. Således anser vi att time-lapse video-mikroskopi av primära murina hjärnbarken celler odlade i hög densitet är en kraftfull och tillgängliga verktyg att studera cellulära och molekylära mekanismer av cellcykelns förlopp, celldelning, cellöverlevnad och cell öde specifikation. Dessa produkter kan åstadkommas med transgena djur, möjliggör identifiering av viss cell öden på realtid38,39,40 eller användning av efter imaging immuncytokemi3,38,41,42.
Här, ger vi en steg för steg-protokollet för att förbereda primära hjärnbarken cellkultur stödja spridningen av Karolina och den efterföljande generationen av nervceller och macroglial celler. Vi diskuterar också användningen av retroviral-medierad transfection att manipulera genuttryck av enskilda celler, som kan identifieras och spåras på enskild cell nivå med time-lapse video mikroskopi. Detta protokoll kan användas för att studera primära hjärnbarken celler isolerade från början till slutet av corticogenesis hos gnagare, men några justeringar kan krävas enligt den scen14. Karolina isolerade från andra källor kan också studeras med time-lapse video mikroskopi av 2D kulturer, men lämpliga culturing systemet bör fastställas genom att jämföra cell beteenden in vitro- och in-vivo38,43.
Realtid observation av primära hjärnbarken celler gör analysen av cellproliferation, celldelning, cellcykelns längd, celldifferentiering och cell överlevnad3,14,15,37. Viktigare, tillåter det studier av encelliga härstamningar, leder till identifiering av de mellanliggande etapperna antagit under progression från Karolina till nervceller3. Slutligen, kombinatione…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av CNPq (Conselho Nacional de skattemyndigheten Científico e Tecnológico), uddar (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) och FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa do Rio Grande do Norte).
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
Isoflurane | Sigma | 792632 | |
anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
ImageJ | NIH | ||
tTt | ETH Zurich | ||
Cell observer microscope | Zeiss | ||
Pasteur pipette | |||
PBS | |||
The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |