Vi tillhandahåller enkla och robusta protokoll för bearbetning av biopsiematerial av olika arter, embryon av biomedicinska modellorganismer och prover av andra organiska vävnader för att möjliggöra digital volymdatagenerering med den högupplösta episkopiska mikroskopi-metoden.
Vi tillhandahåller enkla protokoll för att generera digitala volyldata med den högupplösande episkopiska mikroskopi-metoden (HREM). HREM kan bilda organiska material med volymer upp till 5 x 5 x 7 mm 3 i typiska numeriska upplösningar mellan 1 x 1 x 1 och 5 x 5 x 5 μm 3 . Proverna är inbäddade i metakrylatharts och snittas på en mikrotom. Efter varje sektion fångas en bild av blockytan med en digital videokamera som sitter på fotobunken ansluten till det sammansatta mikroskophuvudet. Den optiska axeln passerar genom en grön fluorescerande protein (GFP) filterkub och är inriktad på en position, vid vilken bockhållarmen kommer vila efter varje sektion. På så sätt produceras en rad naturligt anpassade digitala bilder som visar efterföljande blockytor. Att ladda en sådan bildserie i tredimensionell (3D) visualiseringsprogramvara underlättar omedelbar konvertering till digital volymdata, vilket möjliggör virtuella sEktionering i olika ortogonala och snedställda plan och skapandet av volym och ytframställda datormodeller. Vi presenterar tre enkla, vävnadsspecifika protokoll för behandling av olika grupper av organiska exemplar, inklusive mus, kyckling, vaktel, groda och zebrafiskembryon, humant biopsimaterial, obestruket papper och hudbytesmaterial.
Strukturell analys av organiska och oorganiska material är det första steget i att förstå deras fysiska egenskaper och funktion. Grunden för en sådan analys är ofta tvådimensionell (2D) information som erhållits genom noggrann observation av histologiska sektioner, med en mängd enkla och sofistikerade avbildningsmetoder som extraherar detaljer om vävnadsarkitektur, cellmorfologi och topologi, molekylär sammansättning och biomekaniska egenskaper 1 , 2 , 3 . 2D-information är emellertid inte lämpad för att undersöka rumsligt komplexa arrangemang. Därför etablerades ett växande antal in vivo och ex vivo metoder som möjliggör generering av digitala volyldata under de senaste decennierna 4 och många fler är under utveckling.
Den metodiska principen för mest volymdatagenereringsmetoder är genereringen av virtuella staplarAv digitala bilder som visar sektioner som erhållits genom virtuell eller fysisk sektion av ett objekt. Om sektionsbilderna är rätt inriktade skapas en volym, som kan snittas om i virtuella sektionsplan eller används för att skapa 3D-ytor och volymåterställda modeller. Populära tekniker för visualisering av människor och större biologiska prover är magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronutsläppstomografi (PET) och single-photon emission computed tomography (SPECT). Små exemplar visualiseras vanligtvis genom användning av mikromagnetisk resonansbildning (μMRI), optisk projektionstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologiska sektionsbaserade metoder, konfokalmikroskopi och elektrontomografi 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10 <sUpp>, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
En relativt ny volymdatagenereringsteknik som producerar digitala data för småprover och histologiska vävnadsprover är HREM-metoden, som utvecklades i nära samarbete med Tim Mohun 18 , 19 . Det är en enkel mikroskopbaserad teknik, som genererar digital volymdata från hartsinbäddat material som är snittat på en mikrotom. Uppgifterna underlättar detaljerad analys av vävnadsarkitektur och cellfördelningar såväl som metrisk analys av små funktioner på en mellanliggande ljusmikroskopisk nivå.
HREM producerar staplar av iboende justerade digitala bilder som visas som om de tagits från eOsinfärgade histologiska sektioner. Vävnadskontrast och dataupplösning i förhållande till synfältet överstiger den för data som produceras med μCT, μMRI och OPT, men är lägre än vad som kan uppnås med konfokal, ljusark och elektronmikroskopi 20 . I motsats till det senare kan HREM dock visualisera prover med relativt stora volymer upp till 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. Ett antal nyligen genomförda studier ger detaljerade karaktäriseringar och jämförelser av fördelar och nackdelar med de enkla bildteknikerna och, för saklighets skull, hänvisar vi till dem för ytterligare information om deras begränsningar och potentiella användningsområden 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .
Denna studie fokuserar på HREM imaging-metoden och syftar till att tillhandahållaMycket enkla protokoll för att generera HREM data av ett brett spektrum av organiska material, liksom exempel på deras tillämpning. Arbetsflödet för att skapa HREM-data är enkelt och gäller alla material som kan bädda in i metakrylatharts ( Figur 1 ). Ändå finns det vävnadsspecifika skillnader i provberedning, som måste beaktas. Vi tillhandahåller därför tre standardprotokoll för att förbereda olika prover. Inbäddning och dataproduktion protokoll steg är identiska för dem alla.
HREM är en mycket robust mikroskopisk metod som är idealisk för visualisering av ett brett spektrum av organiska material som används inom biomedicin och industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Det kan användas som en exklusiv bildhanteringsmodalitet, som för närvarande används av programmen för utvecklingsstörningar (DMDD) 41 , 42 <suP>, 43 , 44 eller som en integrerande del av multimodala avbildningsrörledningar 45 .
En fullt fungerande HREM-datagenereringsapparat kan monteras från konventionella laboratoriekomponenter och innefattar ett motoriserat mikrotom, mikroskop, motoriserat korsbord och en dator med lämplig mjukvara 25 . Det är kritiskt att använda en mikrotom utrustad med en blockhållare som reproducerbart stannar efter varje sektion vid en bestämd position och GFP-filterbitar i den optiska vägen. Dock kan helt fungerande allomfattande lösningar köpas från företag som Indigo Scientific.
HREM står inför samma begränsningar som alla histologiska tekniker, förutom att inga artefakter införs under sektion eller sektionsmontering. Det finns emellertid begränsningar som beror på nödvändigheten att fläcka prover före snittning ochFrån inbyggnadsmaterialets egenskaper. Penetration av eosin genom hela provet krävs för att erhålla tillräckliga vävnadskontraster; Väldigt tätt material, fettvävnader och oorganiska ämnen hindrar effektivt penetration av eosin och detta resulterar i obestämda vävnader i mitten av föremålen. Att använda speciella fixeringsmedel hjälper fläckhalsprover, men det finns fortfarande ingen riktig metod för att fullt ut övervinna problemet. En annan begränsning är att hartser som blockerar mer än 2 cm tenderar att bryta under snittning. Detta kan delvis undvikas genom att klippa prov och bearbeta delar separat.
Korrekt placering av små prov eller prov med oregelbundna ytor i formarna under inbäddning är ofta problematisk. Omproverna med agaros och bearbetning av agarosblocket som beskrivs i protokollet löser vanligtvis detta problem 19 . Ett alternativt tillvägagångssätt, som också hjälper till om blocken bryts under sektionenPå att ta bort det redan härdade blocket från hållaren och bädda in det igen, efter det beskrivna inbäddningsproceduren.
En typisk HREM dataset omfattar 500 till 3 000 enstaka bilder. Dess numeriska upplösning bestäms av avståndet mellan de efterföljande bilderna ( dvs. av sektionstjocklek), karaktäristiken för kameramålet och egenskaperna hos den använda optiken. Vi använde snittjocklekar mellan 1 μm och 5 μm och uppnådde bra resultat, även om de presenterade protokollen inte helt eliminerar sken från artefakterna 20 , 46 . Dessa artefakter orsakas av intensivt färgade vävnader belägna djupt inuti blocket, vilket resulterar i suddning av vävnadsinformation på blockytorna med.
Kamerorna hade måldimensioner på 2.560 x 1.920 pixlar 2 , 2.048 x 2.048 pixlar 2 och 4.096 x 4.096 pixlar 2 och var combiNed med objektiv linser med 1.25X, 2.5X, 5X, 10X och 20X. Detta resulterade i numeriska pixelstorlekar mellan 0,18 x 0,18 μm 2 och 5,92 x 5,92 μm 2 , vilket visade sig vara tillräckliga för 3D-analys av vävnadsarkitektur och cellformer, och även för visualisering av kärnor. Med tanke på den höga numeriska upplösningen bör andra cellorganeller också vara synliga. Otillräckliga kontraster på grund av enkel eosinfärgning, och de optiska egenskaperna hos målen minskar dramatiskt möjligheten att diskriminera strukturer. Den maximala sanna rymdupplösningen för HREM-data, som tar hänsyn till den numeriska bländaren, är ungefär 1 x 1 x 1 μm 3 , och tillåter därför en effektiv diskriminering av strukturer större än ungefär 3 x 3 x 3 μm 3 .
Ett vanligt problem för alla digitala bildtekniker är avvägningen mellan storleken på synfältet, som definierar den del av provet som kan visasD på kameramålet och den numeriska upplösningen av bilden. Ju större synfältet är, desto lägre är den maximala möjliga numeriska upplösningen 46 . Den här HREM-inställningen möjliggör generering av HREM-data med ett synfält mellan 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) som visas i en numerisk upplösning av 0,18 x 0,18 μm 2 och 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25X objektiv) som visas i En numerisk upplösning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternativa, kommersialiserade set-ups kan ge större synfält men på bekostnad av sann upplösning. Ändå ger de utmärkt resultat, så uppenbart från de data som visas på DMDD-programmets hemsida 47 .
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Tim Mohun för sina invalubala bidrag till att utveckla HREM och Petra Heffeter för att ge prov.
JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
KL 2500 LCD | Schott AG | light source |