Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística
Summary
Combinación de ivacaftor y ivacaftor lumacaftor son dos nuevos fármacos de CF. Sin embargo, todavía hay una carencia de entendimiento sobre su PK/PD y farmacología. Presentamos una técnica de HPLC-MS optimizada para el análisis simultáneo de ivacaftor y sus principales metabolitos y lumacaftor.
Abstract
Defectos en el regulador de conductancia trans membrana de fibrosis quística (CFTR) son la causa de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad con manifestaciones pulmonares mortales. El ivacaftor (IVA) y combinación de ivacaftor-lumacaftor (LUMA) son dos nuevos medicamentos avance CF que modulan directamente la actividad y el tráfico de la proteína CFTR defectuosa. Sin embargo, todavía hay una falta de entendimiento en los parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos y la farmacología de ivacaftor y lumacaftor. La técnica de HPLC-MS para el análisis simultáneo de las concentraciones de ivacaftor, hidroximetil-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate y lumacaftor en fluidos biológicos en pacientes que reciben la combinación estándar de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia ha sido desarrollada por nuestro grupo y validado parcialmente a las normas de la FDA. Sin embargo, para permitir el análisis de alto rendimiento de un mayor número de muestras de pacientes, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño (2.6 μm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) y un sistema solvente degradado ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: en 70% B; 2.7-2,8 min: 70-90% de B; 2,8-4,0 min: 90% lavado de B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1 6.0 min: en 40% B) en lugar de una elución isocrática. El objetivo de este estudio era reducir el tiempo de análisis HPLC-MS por muestra dramáticamente de ~ 15 minutos a sólo 6 minutos por muestra, que es esencial para el análisis de una gran cantidad de muestras de pacientes. Este método conviene será de gran utilidad para estudios en las relaciones exposición-respuesta de estas drogas de CF de avance.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética común que implica las glándulas exocrinas de la mucosa del pulmón, hígado, páncreas y los intestinos causando insuficiencia multiorgánica progresiva, como una disminución en la función pulmonar y la insuficiencia pancreática1, 2,3. Ivacaftor (IVA) es el primer Food and Drug Administration (FDA-US) y Agencia Europea de medicamentos (EMA) aprobó fibrosis quística trans membrana conductancia regulador (CFTR) potenciador de drogas, con eficacia clínica se manifiesta produciendo un significativo mejora la función pulmonar en comparación con placebo en un pequeño subgrupo de pacientes con FQ teniendo la G551D-CFTR [glicina (G) en posición 551 es reemplazado por ácido aspártico (D)] mutación sin sentido (~ 4-5% de la población de CF)4,5. Esto administrados por vía oral drogas aumenta el canal CFTR abriendo, así aumentar el flujo de iones de cloruro y actuando sobre el defecto primario que conduce a las manifestaciones clínicas de CF4,6. Lamentablemente, IVA monoterapia no es eficaz en pacientes con la mutación más común de F508del homocigótica [en canceladura del marco del gen CFTR que se traduce en la pérdida de la fenilalanina (F) en la posición 508] que resulta en mal plegada CFTR, que se observa en ~ 50% de la población de CF7,8.
Recientemente, la FDA otorgó la aprobación para combinar IVA con el corrector CFTR lumacaftor drogas. La inteligente estrategia de combinar un corrector CFTR (lumacaftor LUMA) que rescata la F508del-CFTR a la superficie de la célula con un modulador (IVA) que potencia la actividad del canal CFTR, efectivamente se expande la ventana de tratamiento a la mayoría de la población de CF5 . Sigue habiendo preguntas sobre si estos fármacos cumplirá su promesa como un número de informes contradictorios han emergido poner en duda sobre su eficacia clínica9,10. Además, mejoras en la función pulmonar fueron sólo modesto (2.6-4% para combinación ivacaftor-lumacaftor) en comparación con el éxito alcanzado con la monoterapia en pacientes con una mutación (10.6-12,5%) de G551D8de IVA. Posibles interacciones de fármacos antagonistas entre IVA y LUMA que limitan potencialmente la eficacia clínica de la combinación lumacaftor ivacaftor provienen de sus propiedades farmacocinéticas ideal menos de7,11. IVA es ampliamente metabolizada por las enzimas del citocromo P450 (CYP), principalmente a un metabolito activo hidroximetil-IVA (IVA-M1, M1) y una forma inactiva de7,IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)12. El inductor de CYP3A4 LUMA, por otro lado, no se metaboliza extensamente y en gran parte se excreta inalterado en la heces11. Como inductores de CYP3A4 inducen metabolismo del citocromo, se podrían reducir concentraciones ivacaftor (sustrato de CYP3A4). Por otra parte, tanto el IVA como LUMA son moléculas muy hidrofóbicas y están obligado ~ 99% a proteínas plasmáticas, que limita significativamente la concentración de libre de drogas (activo)1,13.
Colectivamente, estos factores pueden ser que se reúnen para limitar la eficacia clínica de la combinación de ivacaftor-lumacaftor. No se sabe si se alcanzan las concentraciones plasmáticas óptimas bajo el actual régimen de dosificación para el ivacaftor-lumacaftor combinación o si el umbral terapéutico se mantiene8. Actualmente, hay una escasez de información sobre los parámetros farmacocinéticos como el pico y las concentraciones plasmáticas de estado estacionario de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dado el notable metabolismo de ivacaftor y lumacaftor, seguimiento de las relaciones exposición-respuesta es requisito para alcanzar regímenes de dosis óptima para tratamiento ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Nuestro grupo ha publicado recientemente el primer método HPLC, LC-MS para la supervisión de las relaciones exposición-respuesta de IVA y LUMA14. No hay técnicas alternativas de medición de las concentraciones de ivacaftor, sus metabolitos y lumacaftor se han divulgado hasta la fecha. Para permitir el análisis de alto rendimiento de un colectivo de pacientes mayor y para reducir drásticamente el tiempo de análisis, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño y un sistema solvente degradado que reduce costos y tiempos en marcha.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se informó anteriormente, nuestro grupo tiene por primera vez desarrollado y validado un método de HPLC y LC-MS para la detección y cuantificación de ivacaftor y sus principales metabolitos hidroximetil-IVA M1 (activo) y el IVA-carboxylate M6 (inactivos); y lumacaftor en el plasma y el esputo de pacientes de CF14. El análisis divulgado previamente por nuestro grupo fue utilizado con éxito para cuantificar la concentración de LUMA, IVA, IVA-M1 y M6 de IVA en el plasma y el esputo de pac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L. y T.V. son apoyados por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (R01 AI111965). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas o los institutos nacionales de salud. MC es un investigador australiano NHMRC Principal. J. L. es nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) Senior Research Fellow, y T.V. es un australiano NHMRC industria carrera desarrollo nivel 2 investigador. E.K.S es un 2017 joven Embajador designado para ASM (sociedad estadounidense de Microbiología) y es apoyado por la concesión australiana del postgrado.
Partes de este trabajo fue presentado en la 12th Conferencia incesante en la Fibrosis quística en Melbourne (5-8th de agosto de 2017).
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
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