In Vitro Caracterização das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos
Summary
Função sensorial anormal subjacente a dor visceral e outros sintomas de doenças inflamatórias e funcionais do intestino. Um protocolo para a gravação eletrofisiológica dos nervos aferentes do cólon em uma preparação de colorectum de rato ex vivo é apresentado aqui.
Abstract
Disfunção dos nervos sensoriais do cólon tem sido implicada na fisiopatologia de várias condições comuns, incluindo diabetes e doenças inflamatórias e funcionais do intestino. Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização em vitro das propriedades eletrofisiológicas de afferents Colônica em ratos. O colorectum, com o gânglio pélvico intacto (PG), anexado, é removido o rato; superfused com carbogenated solução de Krebs na câmara de gravação; e canulado nas extremidades para permitir a distensão orais e anais. Um feixe de nervos bem emana o PG é identificado, e a atividade do nervo aferente multiunit é gravada usando um eletrodo de sucção. Distensão do segmento do cólon provoca aumentos graduais na descarga multiunit. Uma análise de componentes principais é realizada para diferenciar o baixo limiar, o limite de alta e as fibras aferentes de alcance dinâmico largo. Sensibilidade química de afferents do cólon pode ser estudada através da administração de banho ou intraluminal de compostos de teste. Este protocolo pode ser modificado para aplicação a outras espécies, como ratos e cobaias e para estudar as diferenças nas propriedades eletrofisiológicas de afferents toracolombar/hipogástrica e lombossacral/pélvica do cólon descendente no normal e condições patológicas.
Introduction
O trato gastrointestinal (GIT) é ricamente inervado com nervos aferentes extrínsecos que transmitem sinais sensoriais do intestino para o sistema nervoso central e que contribuem para a interação do intestino-cérebro. Excitabilidade alterada destas afferents extrínseca, bem como alterado processamento central das entradas aferentes, subjaz dor visceral e outros sintomas de condições de GI, incluindo de doenças intestinais inflamatórias e funcionais1. Informações sensoriais do colorectum são transmitidas principalmente pela toracolombar/hipogástrica e os nervos pélvicos/lombossacral (PN)2. Tem havido um aumento do interesse em estudar as propriedades eletrofisiológicas destas fibras aferente primário em modelos de roedores doença. No entanto, na vivo eletrofisiológicos gravações das afferents Colônica em roedores é um desafio técnico e exige consideráveis habilidades cirúrgicas. Além disso, alterações hemodinâmicas, movimento de tecido e anestésicos também afetam atividade do nervo e sensibilidade para testar estímulos na vivo. Portanto, nos últimos anos, um número crescente de estudos têm utilizado em vitro (ex vivo) preparações de diferentes espécies, incluindo ratos, ratos, cobaias e seres humanos, para examinar os mecanismos de transdução sensorial no cólon afferents e a excitabilidade alterada em condições de doença. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Foram relatados principalmente dois tipos de ex vivo Colônica preparação: a preparação do “plano-folha”5,9,10 e a preparação de “tubo”3,4. Um protocolo de vídeo para a preparação de murino colorectum “da liso-folha” tem sido previamente publicado11. Neste protocolo, o colorectum do mouse, com o PN) ou esplâncnico nervos lombares (LSN) anexados, é colhido e superfused em uma câmara de tecido. O colorectum é aberto no sentido longitudinal, e o feixe de nervos é estendido em um compartimento de gravação com óleo de parafina. Atividade do nervo é gravada usando um eletrodo de platina-irídio monopolar. O protocolo permite a identificação dos campos receptivos de fibras aferentes individuais usando estimulação elétrica não-polarizada. Ele localiza a aplicação de estímulos químicos, bem como a aplicação dos paradigmas diferentes estimulação mecânica (por exemplo, focal da mucosa de sondagem e circunferencial stretch), para as terminações nervosas aferentes. Porque o nervo deve ser estendido a uma câmara separada da câmara de tecido, é fundamental para manter o nervo anexado relativamente longo; a dissecação bem sucedida dos nervos representa um desafio para aqueles novos para esta metodologia. Mais recentemente, Nullens et al publicou um protocolo de vídeo para a gravação em vitro o afferents mesentérica murino jejunal e segmentos do cólon12. Esta preparação de “tubo”, o segmento de intestino com o mesentério anexado é mantido intacto, permitindo assim distensão gradual e a administração intrae extra-luminal de diferentes produtos químicos. Desde que o nervo do mesentério é gravado usando um eletrodo de sucção, que pode ser posicionado perto do tecido, atividade aferente pode ser gravada, mesmo que o nervo do mesentério é relativamente curto. No entanto, o nervo do mesentério consiste de populações mistas de fibras aferentes vagais e espinhais que inervam o jejuno ou toracolombar hipogástrica. Lombossacral pélvicas afferents inervam o colorectum, que não pode ser discriminado no presente protocolo. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a gravação eletrofisiológica do rato Colônica afferents usando a preparação de colorectum de “tubo” com um PG. intacta Este método permite a caracterização das propriedades funcionais da lombar esplâncnico (hipogástrica) e lombossacral afferents pélvica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado é um método relativamente simples experimental para avaliar as propriedades eletrofisiológicas das afferents Colônica de ratos. O protocolo (a partir de dissecção de tecidos para configurar a gravação de nervo) normalmente leva cerca de 2 h para completar. Coleção de tecido (passo 3) e preparação do eletrodo sucção (etapa 5) são os passos críticos. É fundamental ser capaz de localizar o PG, o LSN e o PN e tome cuidado para não danificar o gânglio e nervos durante a dissecç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este protocolo foi apoiado por bolsas de investigação do Nacional Natural Science Foundation da China (#31171066, #81270464) e do centro de ciência de Sino-alemão (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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