高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology,University of Copenhagen
Summary
シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.
Abstract
ドーパミン (DA) は、運動、報酬プロセスおよび認知機能の制御調節神経伝達物質です。(ドーパミン) ドーパミン作動性神経伝達の障害がパーキンソン病、注意欠陥・多動性障害、薬物中毒1,2 などいくつか中枢神経関連疾患に強く関連付けられて ,3,4。DA の不均衡を含む疾患のメカニズムの輪郭を描くが、病気の面を模倣する動物モデルに大きく依存してこうして DA 恒常性の特定の部分を評価プロトコルは知見と可能な治療を提供することが重要です。これらの疾患のためのターゲット。
今回 2 つの有用な実験的プロトコルを組み合わせるとマウスのドーパミン系の機能読み出しを提供します。DA の恒常性の生化学的, 機能的パラメーターは、DA のレベルとドーパミン トランスポーター (DAT) 機能5の評価を通じて取得されます。DA システムを調査するときは、確実に大人の頭脳から DA の内因性のレベルを測定する能力が不可欠です。したがって、我々 は DA のレベルを決定するマウスから脳組織に高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を実行する方法を提示します。背側線条体 (dStr) と側坐核 (NAc) から組織の実験を実施、他の DA 支配されている脳の領域に適していますまた。
DAT は DA のシナプス前終末に再取り込みのために不可欠にリリースされた DA の時空の活動を制御DA の恒常性を評価する際の主要な重要性はレベルと線条体で DAT の機能を知ることです。ここでは、表面レベルでシナプトソーム6 DA 取り込みアッセイを使用して関数情報を同時に推定することができますプロトコルを提供します。
標準免疫ブロット プロトコルと組み合わせて現在のメソッドは、ドーパミンのシステムを特徴づける関連ツールと研究者を提供します。
Introduction
ドーパミン (DA) は、モーターの挙動、報酬と認知機能1,7,8,9の重要な調節神経伝達物質です。DA の恒常性の不均衡は、注意欠陥多動性障害、薬物中毒、うつ病、パーキンソン病1などいくつかの脳神経疾患に関与しています。DA は、さらにそれにより信号を伝達、どこに、前及びシナプス後膜の受容体を活性化、シナプスの間隙にシナプス前ニューロンから解放されます。リリース後シナプスの DA のレベルは、DAT3,10によって空間的そして一時的に制御されます。トランスポーター sequesters DA 細胞外スペースから、こうして生理 DA レベル3,11を支えます。マウスで DAT の遺伝的除去 hyperdopaminergic 表現はシナプスの DA レベルが上昇によって特徴付けられる細胞内 DA プール、10、12をシグナル伝達シナプスのドーパミンの深遠な変更の枯渇が発生します。
ここでは、2 つの別々 のプロトコルが表示される、メジャー ダ組織コンテンツと別のガブリエルら13によって記述された表面ビオチン化アッセイとダット複合機能を評価する方法の 1 つこれらの 2 つの方法は、DA に関する情報を提供DA の恒常性の完全な査定の DAT のコンテンツと機能のレベル。これらのメソッドで様々 な遺伝子改変マウスや疾患モデルの DA 恒常性を特徴とし、説明できます。これらのツールを実装して最適化されており、当社の研究所で標準使用。現在の試金は DAT14の C 末端を改変、チロシン水酸化酵素 (TH) プロモーター 5下 Cre リコンビナーゼを発現の DA の恒常性に与える影響を調査するため提供しています。
Protocol
デンマークの動物実験局のガイドライン (許可番号: 2017-15-0201-01160) 続いた実験動物愛護の監督の下で完全に AAALAC 認定施設で、委員会。 1 シナプトソーム ドーパミン取り込み (法 1) 注: このプロトコルは 2 つの脳の並列評価が 4 脳シナプトソーム DA 吸収実験を実行する正常に使用することができます。並列。 準備 ラベル …
Representative Results
現在 DA 取り込みプロトコル (図 1) には、マウスから得たシナプトソームで DAT の機能を評価するために必要なすべての手順が含まれています。DA 吸収法 (図 2) の代表的なデータは、未調整のデータ (図 2 b) と飽和曲線を示しています、調整データ (図 2 a)。飽和曲線は、野生型マ?…
Discussion
本稿では、選択肢の任意のマウス モデルの DA 恒常性を記述する有用な実験的プロトコルについて説明します。ダット DA 輸送機能を評価するために高速液体クロマトグラフィーとシナプトソーム DA 吸収を用いたマウスから DA の脳組織のレベルを測定の詳しいプロトコルをいたします手順、プロトコルおよび高速液体クロマトグラフィーの実験とシナプトソーム DA 取り込みアッセイの制限、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、UCPH 2016 プログラムの卓越性 (アリフール、u. g. k. j.) によって支えられた、ルンドベック財団 (原産地) 膜のナノ医療 (u. g.)、国立研究所の健康補助金 P01 DA 12408 (u. g.)、デンマーク ルンドベック財団センター-医療科学 (u. g.) の独立した研究協議会。
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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Cite This Article
Jensen, K. L., Runegaard, A. H., Weikop, P., Gether, U., Rickhag, M. Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake. J. Vis. Exp. (127), e56093, doi:10.3791/56093 (2017).