Profilering Anti-Neu5Gc IgG i humant serum med en Sialoglycan Microarray Assay
Summary
Et sialoglycan-mikroarray-assay kan anvendes til at evaluere anti-Neu5Gc-antistoffer i humane sera, hvilket gør det til et potentielt diagnostisk test med høj gennemløb for kræft og andre kroniske inflammationsmedierede humane sygdomme.
Abstract
Celler er dækket af en kappe af kulhydratkæder (glycaner), der almindeligvis ændres i kræft, og som omfatter variationer i sialinsyre (Sia) -ekspression. Disse er sure sukkerarter, der har en 9-carbon backbone, og at hatte hvirveldyr glycaner på celleoverflader. To af de vigtigste Sia-former i pattedyr er N- acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og dens hydroxylerede form, N- glycolylneuraminsyre (Neu5Gc). Mennesker kan ikke producere endogent Neu5Gc på grund af inaktiveringen af genet kodende for cytidin 5'monophosphat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Udenlandske Neu5Gc er erhvervet af humane celler gennem kostforbruget af rødt kød og mejeri og ses efterfølgende på forskellige glykaner på celleoverfladen, der hovedsagelig ophobes på carcinomer. Følgelig har mennesker cirkulerende anti-Neu5Gc-antistoffer, der spiller forskellige roller i kræft og andre kroniske inflammationsmidlede sygdomme, og som bliver potentielle diagnostiske og terapeutiske lægemidlerrgets. Her beskriver vi et high-throughput sialoglycan microarray assay for at vurdere sådanne anti-Neu5Gc antistoffer i humane sera. Neu5Gc-holdige glycaner og deres matchede kontrolpar (Neu5Ac-holdige glycaner), hver med en primær amin, er kovalent bundet til epoxy-coatede glasskinner. Vi eksemplificerer udskrivning af 56 dias i 16-brøndsformat ved hjælp af en specifik nanoprinter, der kan generere op til 896 arrayer pr. Print. Hvert dias kan bruges til at screene 16 forskellige humane sera prøver til evaluering af anti-Neu5Gc antistof specificitet, intensitet og mangfoldighed. Protokollen beskriver kompleksiteten af dette robuste værktøj og giver en grundlæggende retningslinje for dem, der sigter mod at undersøge svaret på Neu5Gc diætcarbohydratantigen i forskellige kliniske prøver i et arrayformat.
Introduction
Sias er sure sukkerarter, der dækker glycan kæder på celleoverflade glycoproteiner og glycolipider hos hvirveldyr. Sia-ekspression er modificeret i cancerceller 1 og korrelerer med progression og / eller metastase 2 , 3 . To af de store Sia former i pattedyr er Neu5Ac og dens hydroxyleret form Neu5Gc 2. Mennesker kan ikke syntetisere Neu5Gc på grund af en specifik inaktivering af genet kodende for CMAH-enzymet. Denne ikke-humane Sia inkorporerer metabolisk i menneskelige celler som "selv", der stammer fra kostholdige Neu5Gc-rige fødevarer ( fx rødt kød) 4 , 5 . Neu5Gc er til stede i lave niveauer på celleoverfladerne af human epithelia og endothelia, men det akkumuleres især i carcinomer. Neu5Gc er anerkendt som fremmed af det humane humoral immune system 2 , 6 .Den antigeniske kompleksitet af Neu5Gc-glycaner kan opstå på flere niveauer, herunder Neu5Gc modifikation, binding, underliggende glycaner og stilladser, og deres tæthed, som alle afspejles af kompleksiteten af anti-Neu5Gc-antistofrespons hos mennesker 6 . Nogle af disse antistoffer tjener som carcinombiomarkører og potentielle immunoterapeutika 7 . Fremkomsten af den kemoenzymatiske syntese af forskellige sialoglycaner 8 banede vejen for den mere dybtgående analyse af sådanne antistoffer, lette ved anvendelse af glycan mikroarray teknologi 9 , 10 . Med den lettere forberedelse og manipulation af store biblioteker af naturlige og syntetiske kulhydrater er glycanmikarrayser blevet en stærk høj-gennemstrømningsteknologi til undersøgelse af vekselvirkningerne af kulhydrater med et utal af biomolekyler 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . I et arrayformat anvendes der små mængder materialer, og denne multivalente visning af biologisk relevante glycaner muliggør undersøgelse af tusindvis af bindende interaktioner i et enkelt forsøg. Det er vigtigt, at denne teknologi også kan anvendes til biomarkøropdagelse og til overvågning af immunresponser i forskellige prøver 7 , 12 .
Succesfuld fremstilling af glykan mikroarray kræver overvejelse af tre vigtige aspekter: printerrobotypen, glykan-konjugationskemi og detektionsoptik. Med hensyn til udskrivningsinstrumentet er der to teknikker til rådighed: kontakt- og ikke-kontaktprintere. Ved kontaktudskrivning dyppes 1-48 stålstifter i en multi-well-kildeplade indeholdende glycanopløsning og ses på funktionaliserede glasskinner ved direkte at kontakte glasskærmens overflade. Opløsningen er deLeveret til diaset er en funktion af den langvarige varighed på diasoverfladen. Normalt er prøverne først forspottet på en glasblok (for at nå homogene punkter), før de trykkes på glidens overflade. I ikke-kontaktprintere ( fx den piezo-elektroniske printer), udskrives glycanerne fra en glaskapillær ved hjælp af kontrollerede elektriske signaler. Det elektriske signal kan finskalibreres for at opnå mere præcis udskrivning i forhold til kontaktudskrivning. Pletternes størrelse og morfologi er også relativt mere homogene. En yderligere fordel er genbrug af prøven tilbage til kildeskiltet efter udskrivning. Ikke desto mindre er den største ulempe ved piezo-elektroniske printere trykbegrænsningen (4 eller 8), hvilket resulterer i en meget lang udskrivningstid, hvilket kræver særlig opmærksomhed på glidestabilitet, temperatur, fugtighed og prøvefordampning. Inkjet-printeren uden kontakt kræver større prøvevolumener 14 .
<p class = "jove_content"> I modsætning til de begrænsede tilgængelige muligheder for trykmetoder er glykan-konjugationskemi en mere kompleks betragtning, med mange muligheder at vælge imellem. Udvalgt immobiliseringskemi skal tegne sig for både de aktive grupper på glycanerne og glidoverfladereaktiviteten. Glycanerne, der skal immobiliseres på en specifik mikroarrayoverflade, enten syntetisk syntetiseret eller naturligt isoleret, kræver alle en identisk reaktiv gruppe. Derudover skal glycans være rene og homogene. På den anden side bør immobiliseringsoverfladen og kæden tilvejebringe reproducerbarhed og pålidelig fastgørelsestæthed. Flere immobiliseringsmetoder er blevet udviklet med enten kovalent eller ikke-kovalent (fysisk absorption) vedhæftning 10 , 11 , 12 , 13 . For meget detaljerede oplysninger om trykt glycan microarray teknologi til uindviedeD undersøger, henvis til disse gode anmeldelser 13 , 15 . Det er vigtigt, at den seneste minimale information, der er påkrævet for et glykamikforsøg (MIRAGE), beskriver retningslinjer for prøvepræparation 16 og til rapportering af data fra glykanmikarrayanalyser 17 for at forbedre standarderne i dette voksende felt.Her beskriver vi en detaljeret protokol til fremstilling af sialoglycan-mikroarrays ved hjælp af en bestemt kontakt nano-printer i et 16-brøndsformat. Hver af glycans har en primær amin, der formidler deres kovalente forbindelse til epoxyaktiverede glasskinner. Vi beskriver også udviklingen og analysen af et dias ved hjælp af forskellige humane sera prøver, antistoffer og Sia-bindende plante lectins. Sialoglycan microarray analyser involverer flere store trin, der omfatter array fabrikation, behandling, udvikling og analyse. Array fabrikation kræver planlægning af arRay-layout, forberedelse af glycans og kildeplade, programmering af nano-printeren og udskrivning af diasene. Derefter behandles, udvikles og analyseres diasene ( figur 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
En vellykket glycan microarray-fremstilling kræver omhyggelig planlægning og indeholder flere vigtige trin i protokollen. Disse omfatter: (1) planlægning af blok- og pladelayouterne, der definerer alle efterfølgende parametre ( f.eks. Afstande, afstand, antal prøver og udskrivning); (2) rensning af stifterne og sikring af pin integritet, hvilket er kritisk for styring af spot homogenitet; (3) opretholdelse af høj luftfugtighed under tryk, hvilket er kritisk for at undgå prøveinddampning under lange prin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af en Research Career Development Award fra Israels Kræftforskningsfond, et tilskud fra det israelske nationale nanoteknologiske initiativ og Helmsley Charitable Trust for et fokalt teknologisk område for nanomedicin til personlig terapeutisk medicin (VP-K) og nationalt Institutter for sundhedsbidrag R01GM076360 (til XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
