Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan
Summary
Un dosage de microarray de sialoglycane peut être utilisé pour évaluer les anticorps anti-Neu5Gc dans des sérums humains, ce qui en fait un test de diagnostic potentiel à haut débit pour le cancer et d'autres maladies chroniques à médiation par inflammation chronique.
Abstract
Les cellules sont recouvertes d'un manteau de chaînes de glucides (glycans) qui est couramment modifié dans le cancer et qui comprend des variations dans l'expression de l'acide sialique (Sia). Ce sont des sucres acides qui ont un squelette à 9 atomes de carbone et qui captent des glycans vertébrés sur les surfaces cellulaires. Deux des principales formes de Sia chez les mammifères sont l'acide N- acétylneuraminique (Neu5Ac) et sa forme hydroxylée, l'acide N- glycolylneuraminique (Neu5Gc). Les humains ne peuvent pas produire Neu5Gc endogène en raison de l'inactivation du gène codant pour l'hydroxylase de la cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). L'étranger Neu5Gc est acquis par les cellules humaines grâce à la consommation alimentaire de viande rouge et de produits laitiers et apparaît par la suite sur des glycans divers sur la surface de la cellule, s'accumulant principalement sur les carcinomes. Par conséquent, les humains ont des anticorps anti-Neu5Gc circulants qui jouent divers rôles dans le cancer et d'autres maladies chroniques menées par l'inflammation et qui deviennent potentiellement diagnostiques et thérapeutiquesRgets. Ici, nous décrivons un dosage de microarray de sialoglycane à haut débit pour évaluer ces anticorps anti-Neu5Gc dans les sérums humains. Les glycans contenant Neu5Gc et leurs paires de témoins appariés (glycans contenant Neu5Ac), chacun avec une amine primaire centrale, sont liés de manière covalente aux glissières en verre revêtues d'époxy. Nous illustrons l'impression de 56 diapositives dans un format de 16 puits à l'aide d'une nano-imprimante spécifique capable de générer jusqu'à 896 tableaux par impression. Chaque diapositive peut être utilisée pour cribler 16 échantillons de sérums humains différents pour l'évaluation de la spécificité, de l'intensité et de la diversité des anticorps anti-Neu5Gc. Le protocole décrit la complexité de cet outil robuste et fournit une ligne directrice de base pour ceux qui cherchent à étudier la réponse à l'antigène carbohydrate alimentaire de Neu5Gc dans divers échantillons cliniques dans un format de tableau.
Introduction
Sias sont des sucres acides couvrant les chaînes de glycan sur les glycoprotéines de la surface cellulaire et les glycolipides chez les vertébrés. L'expression de Sia est modifiée dans les cellules cancéreuses 1 et est en corrélation avec la progression et / ou la métastase 2 , 3 . Deux des principales formes de Sia chez les mammifères sont Neu5Ac et sa forme hydroxylée, Neu5Gc 2 . Les humains ne peuvent pas synthétiser Neu5Gc en raison d'une inactivation spécifique du gène codant pour l'enzyme CMAH. Ce Sia non-humain incorpore métaboliquement dans les cellules humaines comme «soi», provenant d'aliments riche en vitamines Neu5Gc ( p. Ex., Viande rouge) 4 , 5 . Neu5Gc est présent à des niveaux faibles sur les surfaces cellulaires de l'épithélium humain et de l'endothélium, mais il s'accumule surtout dans les carcinomes. Neu5Gc est reconnu comme étranger par le système immunitaire humoral humain 2 , 6 .La complexité antigénique de Neu5Gc-glycans peut apparaître à plusieurs niveaux, y compris la modification de Neu5Gc, la liaison, les glycans sous-jacents et les échafaudages, et leur densité, tout en étant réfléchi par la complexité de la réponse des anticorps anti-Neu5Gc chez l'homme 6 . Certains de ces anticorps servent de biomarqueurs de carcinome et d'immunothérapies potentielles 7 . L'apparition de la synthèse chimio-enzymatique de différents sialoglycans 8 a ouvert la voie à une analyse plus approfondie de ces anticorps, facilitée par l'utilisation de la technologie de microarray glycan 9 , 10 . Ainsi, avec la préparation et la manipulation facilitées de grandes bibliothèques de glucides naturels et synthétiques, les microarrays de glycan sont devenus une puissante technologie à haut débit pour étudier les interactions des glucides avec une myriade de biomolécules 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . Dans un format de tableau, des quantités minimales de matériaux sont utilisées, et cet affichage multivalent de glycans biologiquement pertinents permet d'étudier des milliers d'interactions de liaison dans une seule expérience. Il est important de noter que cette technologie peut également être appliquée à la découverte de biomarqueurs et à la surveillance des réponses immunitaires dans divers échantillons 7 , 12 .
La fabrication réussie de microarray de glycan exige la prise en compte de trois aspects importants: le type de robot de l'imprimante, la chimie de la conjugaison du glycan et l'optique de détection. En ce qui concerne la considération de l'instrument d'impression, deux techniques sont disponibles: les imprimantes sans contact et sans contact. Dans l'impression par contact, 1 à 48 broches en acier sont plongés dans une plaque source multi-puits contenant une solution de glycan et sont repérés sur des lames de verre fonctionnalisées en contactant directement la surface de glissement en verre. La quantité de la solution est deLié à la glissière est une fonction de la durée persistante sur la surface de la glissière. Habituellement, les échantillons sont d'abord pré-tachés sur un bloc de verre (pour atteindre des taches homogènes) avant d'être imprimés sur la surface de glissement. Dans les imprimantes sans contact ( par exemple, l'imprimante piézo-électronique), les glycanes sont imprimés à partir d'un capillaire en verre à l'aide de signaux électriques contrôlés. Le signal électrique peut être étalonné finement pour obtenir une impression plus précise par rapport à l'impression par contact. La taille et la morphologie des taches sont également relativement plus homogènes. Un avantage supplémentaire est le recyclage de l'échantillon à la plaque source après l'impression. Néanmoins, l'inconvénient majeur des imprimantes piézoélectriques est la limitation de l'impression (4 ou 8), ce qui donne une durée d'impression très longue, ce qui nécessite une attention particulière à la stabilité du glissement, à la température, à l'humidité et à l'évaporation de l'échantillon. L'imprimante jet d'encre sans contact nécessite des volumes d'échantillons plus importants 14 .
<p class = "jove_content"> Contrairement aux options disponibles limitées pour les méthodes d'impression, la chimie de la conjugaison du glycan est une considération plus complexe, avec de nombreuses options à choisir. La chimie d'immobilisation sélectionnée doit tenir compte à la fois des groupes actifs sur les glycanes et de la réactivité de la surface coulissante. Les glycanes à immobiliser sur une surface de microarray spécifique, synthétisée synthétiquement ou naturellement isolée, nécessitent tous un groupe réactif identique. De plus, les glycans doivent être purs et homogènes. D'autre part, la surface d'immobilisation et la chimie devraient fournir une reproductibilité et une densité d'attache fiables. Des méthodes d'immobilisation multiples ont été développées avec des attaches 10 , 11 , 12 , 13 covalentes ou non covalentes (absorption physique). Pour des informations très détaillées sur la technologie de microarray glycan imprimée pour les non-initiésD enquêteur, se référer à ces excellentes critiques 13 , 15 . Il est important de noter que les récentes informations minimales requises pour une initiative Glycomics Experiment (MIRAGE) décrivent les lignes directrices pour la préparation des échantillons 16 et pour la déclaration des données des analyses de microarrays glycaniques 17 pour améliorer les normes dans ce domaine en pleine croissance.Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la fabrication de microarrays de sialoglycane à l'aide d'une nano-imprimante de contact spécifique au format 16 puits. Chacun des glycanes possède une amine primaire qui sert de médiation à leur liaison covalente aux glissières en verre à activation époxydique. Nous décrivons également le développement et l'analyse d'une diapositive en utilisant divers échantillons de sérums humains, des anticorps et des lectines de plantes liant le Sia. Les tests de microarray de sialoglycane comportent plusieurs étapes importantes qui incluent la fabrication, le traitement, le développement et l'analyse de la matrice. La fabrication de tableau exige la planification de l'arLa disposition des rayons, la préparation des glycans et de la plaque d'origine, la programmation de la nano-imprimante et l'impression des diapositives. Par la suite, les diapositives sont traitées, développées et analysées ( figure 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Une fabrication réussie de microarray glycan nécessite une planification minutieuse et comprend plusieurs étapes importantes dans le protocole. Ceux-ci incluent: (1) la planification des dispositions de blocs et de plaques qui définissent tous les paramètres ultérieurs ( p. Ex. Distances, espacement, quantité d'échantillons et impression); (2) nettoyer les broches et assurer l'intégrité des broches, ce qui est essentiel pour contrôler l'homogénéité des points; (3) maintenir une forte h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par un Prix de recherche sur le développement de carrière du Fonds de recherche sur le cancer d'Israël, une subvention de l'Initiative nationale de nanotechnologie israélienne et le Helmsley Charitable Trust pour une zone de technologie focale sur Nanomedicines pour les théranosites personnalisées (VP-K) et National Instituts de la subvention de santé R01GM076360 (à XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
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