Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링
Summary
시알로 글리 칸 마이크로 어레이 분석은 인체 혈청에서 항 -Neu5Gc 항체를 평가하는 데 사용될 수있어 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에 대한 잠재적 인 고효율 진단 분석법이됩니다.
Abstract
세포는 일반적으로 암에서 변형되고 시알 산 (Sia) 발현의 변화를 포함하는 탄수화물 사슬 (glycans)의 외투로 덮여 있습니다. 이들은 9 탄소 백본을 가지고 있으며 세포 표면에 척추 동물의 glycan을 캡핑하는 산성 당입니다. 포유 동물의 주요 Sia 형태 중 두 가지는 N- 아세틸 뉴 라민 산 (Neu5Ac)과 N- 히드 록 실화 형태 인 N- 글리콜 노 뉴라민 산 (Neu5Gc)입니다. 인간은 cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH)를 암호화하는 유전자의 불 활성화 때문에 내인성 Neu5Gc를 생성 할 수 없다. 외래 Neu5Gc는 붉은 육류 및 유제품의식이 섭취를 통해 인간 세포에 의해 획득되고 이후 세포 표면의 다양한 글리 칸에 주로 나타나 암종에 축적됩니다. 결과적으로 인간은 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에서 다양한 역할을하는 순환 Neu5Gc 항체를 가지고 있으며 잠재적 인 진단 및 치료제가되고있다rgets. 여기, 우리는 인간 항체에서 이러한 안티 Neu5Gc 항체를 평가하는 높은 처리량 sialoglycan microarray 분석을 설명합니다. Neu5Gc 함유 글리 칸과 각각 일치하는 대조군 쌍 (Neu5Ac 함유 글리 칸)은 각각 핵심 1 차 아민과 함께 에폭시 코팅 유리 슬라이드에 공유 결합되어 있습니다. 우리는 인쇄 당 최대 896 개의 어레이를 생성 할 수있는 특정 나노 프린터를 사용하여 16- 웰 포맷으로 56 개의 슬라이드를 인쇄하는 것을 예시합니다. 각 슬라이드는 안티 Neu5Gc 항체 특이성, 강도 및 다양성의 평가를 위해 16 개의 다른 인간 혈청 샘플을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은이 견고한 도구의 복잡성을 설명하고 배열 형식으로 다양한 임상 샘플에서 Neu5Gc식이 탄수화물 항원에 대한 반응을 조사하고자하는 사람들을위한 기본 지침을 제공합니다.
Introduction
Sias는 척추 동물의 세포 표면 당 단백질과 당지질의 글리 칸 쇄를 덮는 산성 당입니다. Sia 발현은 암세포 1 에서 변형되고 진행 및 / 또는 전이와 관련이있다 2 , 3 . 포유 동물의 주요 시아 형태의 두 Neu5Ac 및 수산화 형태, Neu5Gc 2이다. 인간은 CMAH 효소를 암호화하는 유전자의 특정 불활 화 때문에 Neu5Gc를 합성 할 수 없다. 이 비인간적 인 Sia는 Neu5Gc가 풍부한식이 요법 ( 예 : 붉은 고기)에서 유래하여 "자기"로 인간 세포에 대사 적으로 결합합니다 4 , 5 . Neu5Gc는 인간 상피와 내피의 세포 표면에 낮은 수준으로 존재하지만 특히 암종에 축적됩니다. Neu5Gc는 인체 체액 성 면역계에 의해 외국으로 인정됩니다 2 , 6 .Neu5Gc 글리 칸의 항원 복잡성은 모든 인간 6 항 Neu5Gc 항체 반응의 복잡성에 의해 반사, Neu5Gc 수정, 연결, 기본 글리 칸과 비계, 그 밀도 등의 여러 수준에서 발생할 수 있습니다. 이러한 항체의 일부는 암 바이오 마커 및 잠재적 immunotherapeutics (7)의 역할을한다. 다른 sialoglycans (8)의 화학 효소 적 합성의 출현 당쇄 마이크로 어레이 기술 (9) (10)의 사용에 의해 용이 항체의 더 심도 깊은 분석을위한 방법을 닦았다. 따라서, 천연 및 합성 탄수화물의 큰 도서관의 촉진 준비와 조작으로, 글리 칸 마이크로 어레이는 생체 분자 (10), (11)의 무수히 많은 탄수화물의 상호 작용을 조사하기위한 강력한 높은 처리량 기술이있다, </sup> 12 , 13 . 배열 형태로, 최소량의 물질이 사용되며, 생물학적으로 관련이있는 글리 칸의 다가의 디스플레이는 단일 실험에서 수천 개의 결합 상호 작용을 조사 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 기술은 바이오 마커 발견 및 12, 다양한 시료 7에 대한 면역 반응을 모니터링에 적용될 수있다.
성공적인 glycan microarray 제작에는 3 가지 중요한 측면, 즉 프린터 로봇 유형, glycan 접합 화학 및 검출 광학을 고려해야합니다. 인쇄 기기 고려 사항에 관해서는 접촉 및 비접촉식 프린터의 두 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 접촉 프린팅에서 1-48 강철 핀을 글리 칸 용액이 들어있는 멀티 웰 원판에 담궈 유리 슬라이드 표면에 직접 접촉시켜 관능 화 된 유리 슬라이드에 얼룩을지게합니다. 솔루션 금액 de슬라이드에 생존하는 것은 슬라이드 표면의 느린 지속 시간의 함수입니다. 일반적으로 샘플은 슬라이드 표면에 인쇄되기 전에 먼저 유리 블록 (균질 한 지점에 도달하기 위해)에서 미리 얼룩을지게됩니다. 비접촉식 프린터 ( 예 : 압전기 프린터)에서 글리 칸은 제어 된 전기 신호를 사용하여 유리 모세관에서 인쇄됩니다. 접촉 식 인쇄에 비해 더 정밀한 인쇄를 달성하기 위해 전기 신호를 미세하게 조정할 수 있습니다. 스폿의 크기와 형태 또한 비교적 균질합니다. 추가적인 이점은 인쇄 후 시료를 원판에 재활용하는 것입니다. 그럼에도 불구하고 피에조 전자 프린터의 가장 큰 단점은 인쇄 팁 제한 (4 또는 8)으로 매우 긴 인쇄 시간을 초래하며 슬라이드 안정성, 온도, 습도 및 샘플 증발에 특별한주의가 요구됩니다. 비접촉식 잉크젯 프린터에는 더 큰 샘플 용적이 필요합니다 14 .
<p class = "jove_content"> 인쇄 방법에 대한 제한된 사용 가능한 옵션과는 대조적으로, 글리 칸 접합 화학은 선택할 수있는 많은 옵션이있는보다 복잡한 고려 사항입니다. 선택된 고정화 화학은 글리 칸의 활성 그룹 및 슬라이드 표면 반응성 모두를 고려해야한다. 합성 적으로 합성되거나 자연적으로 분리 된 특정 마이크로 어레이 표면 상에 고정화 될 글리 칸은 모두 동일한 반응기를 필요로한다. 또한, glycans은 순수하고 균질해야합니다. 한편, 고정화 표면 및 화학은 재현성 및 신뢰성있는 부착 밀도를 제공해야한다. 공유 결합 또는 비공유 (물리적 흡수) 부착 10 , 11 , 12 , 13 으로 다중 고정화 방법이 개발되었다. Uninitiate를위한 인쇄 된 glycan microarray 기술에 관한 매우 자세한 정보는연구원은 훌륭한 리뷰 13 , 15를 참조하십시오. 중요한 것은 글리코 믹스 실험 (MIRAGE) 이니셔티브에 대한 최근의 최소 필요한 정보는 샘플 준비 (16)과이 성장하는 분야의 표준을 개선하기 위해 (17)을 분석 글리 칸 마이크로 어레이 데이터를보고하기위한 지침을 설명합니다.여기, 우리는 16 웰 형식의 특정 연락처 나노 프린터를 사용하여 sialoglycan microarrays의 제조에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 각 글리 칸은 에폭시 활성화 유리 슬라이드에 대한 공유 결합을 매개하는 1 차 아민을 가지고 있습니다. 우리는 또한 다양한 인간 혈청 시료, 항체 및 Sia 결합 식물 렉틴을 사용하여 한 슬라이드의 개발과 분석을 설명합니다. Sialoglycan 마이크로 어레이 분석은 어레이 제조, 프로세싱, 개발 및 분석을 포함한 몇 가지 주요 단계를 포함합니다. 어레이 제작에는 ar 계획이 필요합니다.나노 그리드 및 소스 플레이트 준비, 나노 프린터 프로그래밍, 슬라이드 인쇄 등의 작업을 수행 할 수 있습니다. 이어서 슬라이드를 처리, 개발 및 분석합니다 ( 그림 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 glycan microarray 제작에는 신중한 계획이 필요하며 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 여기에는 (1) 모든 후속 매개 변수 ( 예 : 거리, 간격, 샘플 양 및 인쇄)를 정의하는 블록 및 플레이트 레이아웃 계획. (2) 핀을 클리닝하고 핀의 완전성을 보장하는 것, 이는 스팟 동질성을 제어하는 데 중요합니다. (3) 인쇄 중 습도를 높게 유지하며, 장시간 인쇄시 샘플 증발을 피하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 부분적으로 Israel Cancer Research Fund의 Research Career Development Award, Israeli National Nanotechnology Initiative의 보조금 및 Personalized Theranostics (VP-K)의 Nanomedicines에 대한 Focal Technology Area의 Helmsley 자선 신탁 및 National 보건 당국 R01GM076360 (XC에).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
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