Generation af en kronisk obstruktiv lungesygdom Model i mus ved gentagne ozon eksponering

Summary

Denne undersøgelse beskriver den succesfulde generation af en ny kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) dyremodel af gentagne gange udsætter mus til høje koncentrationer af ozon.

Abstract

Kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er karakteriseret ved vedvarende luftstrømmen begrænsning og lunge parenkymalt ødelæggelse. Det har en meget høj forekomst i aldrende befolkninger. Den nuværende konventionelle behandlingsformer for KOL fokus primært på symptom-ændring narkotika; udvikling af nye behandlingsformer er således bydende nødvendigt. Kvalificeret dyremodeller for KOL kunne bidrage til at karakterisere de underliggende mekanismer og kan bruges til nye stof screening. Nuværende KOL modeller, såsom LPS (LPS) eller de svin i bugspytkirtlen elastase (PPE)-induceret emfysem model, generere KOL-lignende læsioner i lungerne og luftvejene men ikke ellers ligner patogenesen af menneskelige KOL. En cigaretrøg (CS)-induceret model er en af de mest populære, fordi det ikke kun simulerer KOL-lignende læsioner i luftvejene, men det er også baseret på en af de vigtigste farlige materialer, der forårsager KOL i mennesker. Men de tidskrævende og arbejdskrævende aspekter af modellens CS-induceret dramatisk begrænse dens anvendelse i nye stof screening. I denne undersøgelse genereret vi med succes en ny KOL model ved at udsætte mus til høje niveauer af ozon. Denne model viste følgende: 1) faldt tvungen ekspirationsvolumen 25, 50 og 75/tvunget vital kapacitet (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC og FEV₇₅/FVC), der angiver forværringen af lungefunktion; 2) udvidet lunge alveolerne, med lunge parenkymalt ødelæggelse; 3) reduceret træthed tid og afstand; og 4) øget inflammation. Taget sammen, viser disse data, at ozon eksponering (OE) model er en pålidelig dyremodel, der ligner mennesker fordi ozon overeksponering er en af de ætiologiske faktorer af KOL. Desuden, tog det kun 6-8 uger, baseret på vores tidligere arbejde, at skabe en OE model, der henviser til, at det kræver 3-12 måneder til at fremkalde cigaretrøg model, der angiver, at OE model kunne være et godt valg for KOL forskning.

Introduction

Det er blevet anslået, at KOL, herunder emfysem og kronisk bronkitis, kunne være den tredje hyppigste årsag til dødsfald i verden i 2020^1,2. Potentielle forekomsten af KOL i en befolkning over 40 år gamle skønnes for at være 12,7% hos mænd og 8,3% hos kvinder inden for de næste 40 år³. Ingen medicin er i øjeblikket tilgængelig at vende den gradvise forværring i KOL patienter⁴. Pålidelig dyremodeller for KOL ikke kun kræve efterligning af patologiske sygdomsprocessen men også kræver et kort generation periode. Nuværende KOL modeller, herunder LP’ER eller en PPE-induceret model, kan fremkalde emfysem-lignende symptomer^5,6. En enkelt administration eller en uge-lang udfordring af LP’ER eller PPE til mus eller rotter resulterer i markant neutrofili i bronchoalveolar lavage væske (BALF), øger pro-inflammatoriske mediatorer (fx TNF-α og IL-1β) i BALF eller serum, producerer lung parenkymalt ødelæggelse, udvidede luft rum, og grænser luftstrømmen^5,6,7,8,9,10. Dog LP’ER eller PPE er ikke årsagerne til menneskelige KOL og dermed efterligne ikke den patologiske proces¹¹. En CS-induceret model produceret en vedvarende luftstrømmen begrænsning, lunge parenkymalt ødelæggelse, og reduceret funktionelle motion kapacitet. Men en traditionel CS protokollen kræver mindst 3 måneder til at generere en KOL model^12,13,14,15. Det er således vigtigt at generere en ny, mere effektiv dyremodel, der opfylder de to krav.

For nylig, supplement rygning, luftforurening og erhvervsmæssig eksponering er blevet mere almindelige årsager til KOL^16,17,18. Ozon, som en af de vigtigste forurenende stoffer (dog ikke det vigtigste element i luftforurening), kan direkte reagerer med luftvejene og ødelægge lungevæv af både børn og unge voksne^{19,20,21 ,22,23,24,25}. Ozon, samt andre Stimulatorer, herunder LP’ER, PPE og CS, er involveret i en alvorlig af biokemiske veje af pulmonal oxidativ stress og DNA-skader og er knyttet til indledningen og fremme af KOL^26,27. En anden faktor er, at symptomerne på nogle KOL patienter forværres efter at være udsat for ozon, der angiver, at ozon kan forstyrre lunge funktion^18,28,29. Derfor, vi skabt en ny KOL model af gentagne gange udsætter mus til høje koncentrationer af ozon i 7 uger; Dette resulterede i luftstrømmen defekter og lunge parenkymalt skader ligner dem i tidligere undersøgelser^30,31,32. Vi udvidede OE protokol til hunmus i denne undersøgelse og gengivet korrekt emfysem observeret i mandlige mus i vores tidligere undersøgelser^30,31,32. Fordi KOL dødeligheden er faldet i mænd, men øget hos kvinder i mange lande³³, en KOL model i hunner er nødvendigt at studere mekanismerne og udvikle terapeutiske metoder for kvindelige KOL-patienter. Anvendeligheden af OE model til alle køn giver yderligere støtte til dets anvendelse som en KOL model.

Protocol

Bemærk: The OE model har skabt og brugt i tidligere rapporterede forskning 30 , 31 , 32. Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) i Shanghai Jiaotong Universitet. 1. mus hus patogenfrie, 7 til 9 uger gamle BALB/c hunmus i individuelle ventileret bure i en dyr facilitet under kontrolleret temperatur (20 ° C) og fugtighed (40-60%). Give en 12-…

Representative Results

Eksempler på 3D µCT billeder af hver gruppe er vist i figur 1en. Ozon-eksponerede mus havde en betydeligt større samlede lunge volumen (figur 1en og b) og LAA % (figur 1c) end gjorde luft-eksponerede kontrol mus. Lunge volumen og LAA % forblev forhøjet efter seks uger af ozon eksponering31,32</…

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi en pålidelig metode til at generere en ny KOL model. Sammenlignet med andre modeller (dvs. LP’ER eller PV-modeller), sammenfatter denne OE model den patologiske proces af KOL-patienter. Fordi cigaretrøg er den vigtigste farligt materiale, der forårsager KOL i menneskelige patienter⁴⁰, stadig CS modellen den mest populære KOL model^41,42. CS modellen kræver dog en 3 – 12 måneder R & D …

Materials

BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.