Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

요약

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

포스트 번역 상 수정 단백질의 세포내 신호 변환의 적절 한 규제에 대 한 중요 하다. 이러한 수정 중 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 대상 단백질 유전자의 전사, DNA 수리, 단백질 세포질 과정 통제의 다양 한의 리 진 잔류물에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질은 상호 작용 저하, subcellular 전송 및 신호 변환. 표현과 재조합 태그 단백질 박테리아에는 체 외에서 생 화 확 적인 반응을 간단 하 고 기계적 주소 지정을 위해 적당 한 수의 정화를 기반으로 하는 단백질 SUMOylation 감지 하는 가장 일반적인 방법은 질문입니다. 그러나, vivo에서SUMOylation 과정의 복잡성 때문에 그것은 감지 하 고 분석 단백질 세포, 특히 생 조건에서 SUMOylation 더 도전. 이 문서의 저자에 의해 최근 연구 생 retinoblastoma (Rb) 단백질, 세포 주기 진행의 부정적인 규정 하는 중요 한 종양 억제기 초기 g 1 단계에서 특히 SUMOylated는 밝혔다. 이 종이 검출 및 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 Rb SUMOylation의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rb, 뿐만 아니라 많은 다른 스모 타겟 단백질, 인간 세포에서의 스모 수정 phenotypical 및 기능 조사에 적합 합니다.

서론

진 핵 세포에서 세포 주기 진행의 정확한 컨트롤을 특정 이벤트 정렬된 방식으로^1,2자리 보장 꽉 규제 네트워크를 기반으로 합니다. 이 네트워크에서 핵심 선수 중 하나입니다 (Rb) retinoblastoma 단백질, 첫 번째 복제 종양 억제기^1,3. Rb 단백질은 세포 주기 진행, 특히 S 단계 변화 및 종양 성장^4,5G0/G1의 부정적인 레 귤 레이 터 라고 생각. Rb 함수 실패 하거나 직접 리드 어린이, 가장 일반적인 안구 내부 악성 retinoblastoma, 또는 많은 다른 유형의 암⁵의 개발에 기여 한다. 또한, Rb 세포 분화, chromatin 개장, 및 중재 하는 미토 콘 드리 아는 apoptosis^3,,67를 포함 하 여 많은 세포질 통로에서 포함 된다.<....

프로토콜

1. 탐지의 내 생 Rb SUMOylation 초기 g 1 단계에서

1. 문화 및 세포 주기 동기화 셀.
   1. 유지 HEK293 세포 성장 매체를 포함 하는 Dulbecco에서 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 1% 펜 Strep 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO ₂ 보충.
   2. G0 단계에서 HEK293 세포를 동기화합니다.
   3. HEK293 세포 15 cm에서 hemocytometer와 씨 ~1.5 x 10 ⁷ 셀을 사용 하 여 치료 전에 24 h에 대 한 25 ml 성장 매체와 접시 수
      . 70%-80%, aspirate의 합류에 도달 세척 매체 후 셀 두 번 5 mL와 함께 prewarmed 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).
      1. 추가 25 mL 1% 포함 된 DMEM 페니실린-스와 72 h. 씻어 3 mL 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 접시에서 셀에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. 새로운 5 mL 튜브로 셀 전송.
      2. Cytometry (1.2 단계)에 의해 세포 주기 분석에 셀의 작은 부분을 주제; 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리 하....

결과

세포 주기 진행 하는 동안 내 생 Rb SUMOylation 감지,이 연구 처음 동기화 HEK293 세포 세포 주기 (G0, 초기 G1, G1, S, 및 G2/M)의 5 개의 다른 단계에서이 문서의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로. 동기화의 품질 propidium 요오드 화물 흐름 cytometry 분석 (그림 1) 다음으로 핵 산 얼룩을 사용 하 여 확인 되었다. 다음으로, 셀 수집 되었고 RIPA 버퍼를 변성 시키기 의해 lysed. 스모 프로 테아 제 억제제, N-Ethylmaleimide, 실험 기간 동안 네이티브 스모 신호를 보존 하기 위해 20 mM의 최종 농도에 추가 되었습니다. 비 공유 난다 상호 작용, 그리고 안티-SUMO1 항 체를 사용 하 여 다음 서쪽 오 점 차단 조건을 변성 시키기 아래 생 Rb 종의 immunoprecipitation, 후 스모 신호의 존재 특히 감지에 초기 g 1 단계 (

토론

이 종이 감지 하 여 인간의 세포에 Rb 생 SUMOylation 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 특히 글로벌 스모 관련 신호의 어떤 교체 없이 생 Rb 단백질에 초점이, Rb 스모 수정 완전히 자연 생리 상황 조사를 위한 중요 한 도구입니다.

이 목표를 달성 하기 위해, 그것은 마음에 유지 하는 것이 중요 하는: 1) 스모는 ubiquitination에 비해 4 개의 isoforms (SUMO1-4, 각각 서로 다른 유전자에 의해 부호화)으로 구성, 모든 스모 종은 훨씬 풍부한; 2) 대부분의 스모 대상 단백질에 대 한 스모 활용에 관련 된 효소 사이 지속적인 경쟁의 결과 이며^14,21; deconjugation는 안정 된 상태에서 SUMOylated는 주어진된 단백질의 단지 작은 부분 그리고 3) 스모 목표 SUMOylation 및 deSUMOylation의 급속.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 수정된 독수리 매체 (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
소태아 혈청(FBS)	Thermo Fisher Scientific	26140079
페니실린-스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific	15140122
인산염 완충 식염수(PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
트립신-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Thymidine	Sigma	T9250
Nocodazole	Sigma	M1404
프로피듐 요오드화물	Thermo Fisher Scientific	P3566
Triton X-100	AMRESCO	694
RNase A	써모 피셔 사이언티픽	EN0531
N-에틸말레이미드	시그마	E3876
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	AMRESCO	M107
Nonidet P-40 대체물 (NP-40)	AMRESCO	M158
프로테아제 억제제	Roche	5892970001
마우스 면역 글로불린 G (IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Rb 항체	세포 신호 기술	#9309
단백질 A/G-세파로스 비즈	산타크루즈 생명공학	sc-2003
리포펙타민-2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
니켈 니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 아가로스 비드	Qiagen	30230
이미다졸	시그마	I0250
4%-20% 그래디언트 SDS-PAGE 겔	BIO-RAD	4561096
폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인	Millipore	IPVH00010
Tween-20	AMRESCO	M147
Tubulin 항체	Abmart	M30109
SUMO1 항체	Thermo Fisher Scientific	33-2044
GFP 항체	Abmart	M20004
양고추냉이 과산화효소(HRP) 2차 항체	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
향상된 화학발광(ECL) 키트	Thermo Fisher 과학	32106