אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם
Summary
חלבונים משפחתי קטן הקשורות אוביקוויטין צירוף (סומו) הם מצומדת ל ליזין שאריות לחלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור רטינובלסטומה (Rb) חלבון SUMOylation בתנאים אנדוגני, אקסוגני בתאים אנושיים.
Abstract
השינויים post-translational של חלבונים חיוניים לוויסות תקין של אותות תאיים. בין השינויים האלה, צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו) הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently שאריות ליזין מגוון רחב של חלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים, שעתוק גנים, תיקון ה-DNA, חלבונים האינטראקציה השפלה, תחבורה subcellular ו מעבר אותות. הגישה הנפוצה ביותר כדי זיהוי חלבונים SUMOylation מבוסס על הביטוי ולטיהור מתויג חומרים של חיידקים, המאפשרות במבחנה הביוכימי לתגובה וזה פשוט מתאימים למיעון מכניסטית שאלות. עם זאת, בשל המורכבות של התהליך של SUMOylation ויוו, זה יותר מאתגר כדי לזהות ולנתח חלבון SUMOylation בתאים, במיוחד כאשר תחת תנאים אנדוגני. מחקר שנערך לאחרונה על ידי מחברי המאמר חשף רטינובלסטומה אנדוגני (רובידיום) חלבון, מדכאי מהווה מרכיב ברגולציה השלילית של ההתקדמות מחזור התא, הוא במיוחד SUMOylated בשלב G1 מוקדם. מאמר זה מתאר פרוטוקול זיהוי, ניתוח של Rb SUMOylation בתנאים אנדוגני והן אקסוגני בתאים אנושיים. פרוטוקול זה מתאים החקירה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של הסומו-השינוי של Rb, כמו גם רבים אחרים, ממוקדות סומו חלבונים, בתאים אנושיים.
Introduction
שליטה מדויקת של מחזור התא. להתקדם בתוך התאים האיקריוטים מבוסס על רשת רגולציה הדוקה, אשר מבטיח כי האירועים מתקיימים בצורה מסודרת1,2. אחד השחקנים מפתח רשת זו הוא החלבון רטינובלסטומה (Rb), הראשון משובטים הגידול משתיק קול1,3. חלבון Rb נחשב מווסת שלילי של התקדמות מחזור התא, במיוחד עבור ה-G0/G1 מעבר פאזה S ולאחר גידול צמיחה4,5. כישלון של פונקציה Rb גם ישירות מוביל גידול ממאיר תוך-עיני הנפוצות ביותר אצל ילדים, רטינובלסטומה, או תורם להתפתחות של סוגים רבים אחרים של סרטן5. יתר על כן, Rb מעורב משעולים הסלולר רבים כולל תאית התמיינות, כרומטין שיפוץ של אפופטוזיס המיטוכונדריה בתיווך3,6,7.
שינויים post-translational לשחק תפקיד מרכזי בוויסות RB פונקציה8,9. זרחון הוא אחד שינוי כזה, זה בדרך כלל מוביל Rb איון. בתאים G0 השבתה הדרגתית, Rb פעילה עם רמה נמוכה זירחון. כמו תאים התקדמות דרך שלב G0/G1, Rb הוא ברצף היפר-phosphorylated על ידי סדרה של חלבון cyclin תלוית kinases (CDKs), cyclins, כגון cyclin E/CDK2, cyclin D/CDK4/6, אשר בטל Rb ולחסל את יכולתו לדכא את מחזור התא הקשורים גנים ביטוי4,10. Rb יכול גם להיות שונה על-ידי צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו)11,12,13.
סומו הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently מגוון רחב של חלבונים היעד. . זה קריטי עבור תהליכים תאיים מגוונים, כולל תקנה מחזור התא, שעתוק, לוקליזציה הסלולר חלבון, השפלה, תחבורה ו DNA תיקון14,15,16, 17 , 18. סומו ההטיה מסלול מורכב dimeric סומו E1 הפעלת האנזים SAE1/UBA2, יחיד E2 conjugating האנזים Ubc9, ligases E3 מרובים, פרוטאזות סומו ספציפיים. באופן כללי, חלבונים סומו nascent יש לעבד proteolytically כדי ליצור את הטופס בוגרת. בגלל הסומו בוגרת מופעל על ידי heterodimer E1, הועבר לאחר מכן האנזים E2 Ubc9. בסופו של דבר, גליצין C-מסוף של סומו הוא covalently מצומדת על פי ליזין היעד של מצע, תהליך זה בדרך כלל בהנחייתם של E3 ligases. החלבון סומו ניתן להסיר את המצע ששונה על-ידי פרוטאזות ספציפיים. מחקר קודם על ידי מחברי המאמר חשף כי SUMOylation של Rb מגביר שלה מחייב CDK2, שמוביל hyper-זרחון בשלב G1 מוקדם, תהליך אשר יש צורך מחזור התא התקדמות13. גם להדגים כי האובדן של Rb SUMOylation גורמת שגשוג תאים ירד. יתר על כן, לאחרונה הוכח כי SUMOylation של Rb מגן על חלבון Rb תחלופת proteasomal, ובכך מגדילים את רמת חלבון Rb תאים19. לכן, SUMOylation ממלא תפקיד חשוב בתפקוד Rb בתהליכים הסלולר השונות. כדי להמשיך לחקור תוצאה פונקציונלית והרלוונטיות פיזיולוגיים של Rb SUMOylation, חשוב לפתח שיטה יעילה כדי לנתח את מצב סומו Rb תאים אנושיים או רקמות החולה.
SUMOylation הוא תהליך הפיך, דינמי מאוד. לכן בדרך כלל קשה לזהות את החלבונים סומו-השתנה בתנאים לחלוטין אנדוגני. מאמר זה מציג שיטה לגילוי SUMOylation Rb אנדוגני. יתר על כן, זה מראה איך מזהים SUMOylation Rb אקסוגני של פראי-סוג Rb והן המוטציה שלה לקויה סומו11. בפרט, ג’ייקובס. ואח תיאר שיטה להגדיל את השינוי סומו של מצע נתון במיוחד על ידי SUMOylation (UFDS) מכוון היתוך של Ubc920. מבוסס על שיטה זו, פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח SUMOylation כפויה של Rb והשלכותיה פונקציונלי. בהתחשב בכך מאות סומו סובסטרטים שתוארו קודם לכן, נוסף בשם דיאלקטריים סומו זוהו של מבחני רבים מבוססי פרוטיאומיה מבנית, פרוטוקול זה ניתן להחיל לנתח הסומו-השינוי של אלה חלבונים בתאים אנושיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול לזהות ולנתח SUMOylation אנדוגני של Rb בתאים אנושיים. כפי בשיטה זו מתמקדת באופן ספציפי חלבון Rb אנדוגני ללא כל ההתחלפות של האות הגלובלית הקשורות סומו, זה כלי חשוב עבור חוקרים Rb-סומו שינוי בנסיבות הפיזיולוגיות טבעי לחלוטין.
כדי להשיג מטרה זו, חשוב לזכור כי: 1) למר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי (מענק מס 14411961800) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
