Vivo में मानव कोशिकाओं में आरबी प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने और विश्लेषण
Summary
छोटे ubiquitin-संबंधी संशोधक (सूमो) परिवार के प्रोटीन विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन के lysine अवशेषों को संयुग्मित हैं । यह कागज मानव कोशिकाओं में अंतर्जात और exogenous शर्तों के तहत retinoblastoma (आरबी) प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
Abstract
प्रोटीन के बाद के अनुवाद संशोधन intracellular संकेत transduction के उचित विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं । इन संशोधनों के अलावा, छोटे ubiquitin-संबंधित संशोधक (सूमो) एक ubiquitin प्रोटीन की तरह है कि covalently है लक्ष्य प्रोटीन की एक किस्म के lysine अवशेषों से जुड़ी सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए, जैसे जीन प्रतिलेखन, डीएनए मरंमत, प्रोटीन संपर्क और क्षरण, उपसेलुलर परिवहन, और संकेत transduction । सबसे आम दृष्टिकोण प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने के लिए अभिव्यक्ति और संयोजक बैक्टीरिया में प्रोटीन टैग की शुद्धि पर आधारित है, के लिए अनुमति देता है एक में इन विट्रो जैव रासायनिक प्रतिक्रिया जो सरल और यंत्रवत को संबोधित करने के लिए उपयुक्त है प्रश्न. हालांकि, vivo मेंSUMOylation की प्रक्रिया की जटिलता के कारण, यह अधिक चुनौतीपूर्ण है कोशिकाओं में प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने और विश्लेषण, विशेष रूप से जब अंतर्जात शर्तों के तहत. इस पत्र के लेखकों द्वारा हाल ही में एक अध्ययन से पता चला कि अंतर्जात retinoblastoma (आरबी) प्रोटीन, एक ट्यूमर शमन कि कोशिका चक्र प्रगति के नकारात्मक विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है, जल्दी G1 चरण में विशेष रूप से SUMOylated है । इस पेपर का पता लगाने और मानव कोशिकाओं में दोनों अंतर्जात और exogenous शर्तों के तहत आरबी SUMOylation के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है । इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है सुमो के phenotypical और कार्यात्मक जांच-आरबी के संशोधन, साथ ही साथ कई अंय सूमो लक्षित प्रोटीन, मानव कोशिकाओं में ।
Introduction
युकेरियोटिक कोशिकाओं में कोशिका चक्र प्रगति का सही नियंत्रण एक तंग विनियामक नेटवर्क पर आधारित है, जो यह सुनिश्चित करता है कि विशेष घटनाओं को एक अर्दली तरीके से1,2में जगह ले । इस नेटवर्क में प्रमुख खिलाड़ियों में से एक retinoblastoma (आरबी) प्रोटीन, पहली क्लोन ट्यूमर शमन1,3है । आरबी प्रोटीन के लिए सेल चक्र प्रगति का एक नकारात्मक नियामक, विशेष रूप से G0/एस के लिए चरण संक्रमण है, और ट्यूमर विकास4,5माना जाता है । आरबी समारोह की विफलता या तो सीधे बच्चों, retinoblastoma, या कैंसर के कई अंय प्रकार के विकास के लिए योगदान में सबसे आम intraocular द्रोह की ओर जाता है5। इसके अलावा, आरबी सेल भेदभाव सहित कई सेलुलर रास्ते में शामिल है, क्रोमेटिन remodeling, और mitochondria-मध्यस्थता apoptosis3,6,7.
बाद के अनुवाद संशोधन आरबी समारोह8,9के विनियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । फास्फारिलीकरण एक ऐसी संशोधन है, और यह आमतौर पर आरबी निष्क्रियता की ओर जाता है । quiescent G0 कोशिकाओं में, आरबी एक कम फास्फारिलीकरण स्तर के साथ सक्रिय है । G0/G1 चरण के माध्यम से सेल प्रगति के रूप में, आरबी क्रमिक रूप से हाइपर-phosphorylated cyclin-निर्भर प्रोटीन kinases (CDKs) और cyclins की एक श्रृंखला, जैसे cyclin ई/CDK2 और cyclin डी CDK4/6 के रूप में है, जो आरबी निष्क्रिय और अपनी क्षमता को समाप्त करने के लिए सेल-चक्र दमन संबंधित जीन अभिव्यक्ति4,10. आरबी भी छोटे ubiquitin से संबंधित संशोधक (सूमो)11,12,13द्वारा संशोधित किया जा सकता है ।
सूमो में प्रोटीन जैसी ubiquitin होती है जो कई तरह के लक्ष् य प्रोटीन से जुड़ी covalently है । यह सेल चक्र विनियमन, प्रतिलेखन, प्रोटीन सेलुलर स्थानीयकरण और क्षरण, परिवहन, और डीएनए की मरंमत14,15,16, सहित विविध सेलुलर प्रक्रियाओं, के लिए महत्वपूर्ण है 17 , 18. सूमो विकार मार्ग dimeric सूमो E1 सक्रिय एंजाइम SAE1/UBA2 के होते हैं, एकल E2 conjugating एंजाइम Ubc9, एकाधिक E3 ligases, और सूमो-विशिष्ट टीज़ । आम तौर पर नवजात सूमो प्रोटीन proteolytically परिपक्व रूप उत्पंन करने के लिए संसाधित किया जाना चाहिए । परिपक्व सूमो E1 heterodimer द्वारा सक्रिय है और फिर E2 एंजाइम Ubc9 को हस्तांतरित । अंत में, सूमो के सी टर्मिनल glycine एक सब्सट्रेट के लक्ष्य lysine करने के लिए संयुग्मित covalently है, और इस प्रक्रिया को आम तौर पर E3 ligases द्वारा सुविधा है. सूमो प्रोटीन विशिष्ट टीज़ द्वारा संशोधित सब्सट्रेट से हटाया जा सकता है । इस पत्र के लेखकों द्वारा पिछले एक अध्ययन से पता चला कि आरबी के SUMOylation CDK2 के लिए अपनी बाध्यकारी बढ़ जाती है, जल्दी G1 चरण में हाइपर-फास्फारिलीकरण के लिए अग्रणी, एक प्रक्रिया है जो सेल चक्र प्रगति13के लिए आवश्यक है । हमने यह भी दर्शाया कि आरबी SUMOylation के नुकसान में कमी सेल प्रसार का कारण बनता है । इसके अलावा, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया कि आरबी के SUMOylation proteasomal कारोबार से आरबी प्रोटीन की रक्षा, इस प्रकार कोशिकाओं में आरबी प्रोटीन के स्तर में वृद्धि19। इसलिए, SUMOylation विभिंन सेलुलर प्रक्रियाओं में आरबी समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । आगे कार्यात्मक परिणाम और आरबी SUMOylation के शारीरिक प्रासंगिकता का अध्ययन करने के लिए, यह मानव कोशिकाओं या रोगी के ऊतकों में आरबी की सूमो स्थिति का विश्लेषण करने के लिए एक प्रभावी तरीका विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
SUMOylation एक प्रतिवर्ती, अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है । इस प्रकार, यह आमतौर पर पूरी तरह से अंतर्जात शर्तों के तहत सूमो संशोधित प्रोटीन का पता लगाने के लिए मुश्किल है । यह पेपर अंतर्जात आरबी SUMOylation का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, यह दिखाता है कि दोनों जंगली प्रकार आरबी और उसके सूमो की कमी उत्परिवर्तन11के exogenous आरबी SUMOylation का पता लगाने के लिए । विशेष रूप से, याकूब एट अल. Ubc9 फ्यूजन द्वारा विशेष रूप से दिए गए सब्सट्रेट के सूमो संशोधन को बढ़ाने के लिए एक विधि वर्णित SUMOylation (UFDS)20. इस विधि के आधार पर, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे आरबी की मजबूर SUMOylation और उसके कार्यात्मक परिणाम का विश्लेषण करने के लिए । यह देखते हुए कि सूमो सब्सट्रेट के सैकड़ों पहले से वर्णित किया गया है और अधिक ख्यात सूमो सब्सट्रेट कई proteomic से पहचान की गई है आधारित परख, इस प्रोटोकॉल को सूमो विश्लेषण मानव कोशिकाओं में इन प्रोटीन के संशोधन लागू किया जा सकता है ।
Protocol
1. जल्दी G1 चरण में अंतर्जात आरबी SUMOylation की खोज सेल संस्कृति और सेल चक्र तुल्यकालन । विकास मध्यम में HEK293 कोशिकाओं को बनाए रखने Dulbecco & #39; एस संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 1% पेन-Strep और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) …
Representative Results
Discussion
इस पत्र का वर्णन एक प्रोटोकॉल का पता लगाने और मानव कोशिकाओं में आरबी के अंतर्जात SUMOylation विश्लेषण । इस विधि के रूप में विशेष रूप से वैश्विक सूमो के किसी भी बारी के बिना अंतर्जात आरबी प्रोटीन पर ध्यान केंद्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को शंघाई के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (ग्रांट no. १४४११९६१८००) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं. ८१३००८०५) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
