In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane
Summary
Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.
Abstract
Le modificazioni post-traduzionali delle proteine sono fondamentali per la corretta regolazione della trasduzione del segnale intracellulare. Tra queste modifiche, piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente ai residui di lisina di una varietà di proteine bersaglio per regolare i processi cellulari, come la trascrizione del gene, riparazione del DNA, proteine interazione e degrado, trasporto subcellulare e trasduzione del segnale. L’approccio più comune al rilevamento della proteina sumoilazione si basa sull’espressione e purificazione delle proteine ricombinanti con tag nei batteri, consentendo un in vitro reazione biochimica che è semplice e adatto per l’indirizzamento meccanicistico domande. Tuttavia, a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo, è più difficile rilevare e analizzare la proteina SUMOilazione nelle cellule, soprattutto quando si è in condizioni endogena. Uno studio recente dagli autori di questa carta ha rivelato che la proteina endogena retinoblastoma (Rb), un oncosoppressore che è essenziale per la regolazione negativa della progressione del ciclo cellulare, è specificamente SUMOilate alla fase G1 precoce. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione e l’analisi di SUMOilazione Rb in condizioni sia endogene che esogene in cellule umane. Questo protocollo è appropriato per l’indagine fenotipica e funzionale di SUMO-modificazione del Rb, come pure molte altre proteine SUMO-mirati, in cellule umane.
Introduction
L’accurato controllo della progressione del ciclo cellulare nelle cellule eucariotiche si basa su una fitta rete di regolamentazione, che garantisce che determinati eventi si svolgono in un determinato ordine1,2. Uno dei giocatori chiave in questa rete è la proteina del retinoblastoma (Rb), il primo clonato tumore soppressore1,3. La proteina Rb è pensata per essere un regolatore negativo della progressione del ciclo cellulare, soprattutto per il G0/G1 a transizione di fase S e tumore crescita4,5. Fallimento di funzione di Rb sia direttamente comporta la malignità intraoculare più comune nei bambini, retinoblastoma, o contribuisce allo sviluppo di molti altri tipi di cancro5. Rb è inoltre impegnato in molte vie cellulari tra cui la differenziazione delle cellule, di rimodellamento della cromatina e apoptosi mitocondrio-mediata3,6,7.
Modificazioni post-traduzionali giocano un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione RB8,9. La fosforilazione è una tale modifica, e solitamente conduce all’inattivazione di Rb. In cellule quiescenti G0, Rb è attiva con un livello basso di fosforilazione. Come cellule progressi attraverso fase G0/G1, Rb è in sequenza iper-fosforilato da una serie di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) e cicline, ad esempio ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, che inattivano Rb ed eliminare la sua capacità di reprimere il ciclo cellulare correlate a gene espressione4,10. RB potrebbe essere modificata anche da piccole modificatore ubiquitina-correlate (SUMO)11,12,13.
SUMO è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente a una varietà di proteine bersaglio. È fondamentale per diversi processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, trascrizione, localizzazione cellulare della proteina e degrado, trasporto ed il DNA riparazione14,15,16, 17 , 18. via di Coniugazione il SUMO è costituito dall’enzima d’attivazione di SUMO E1 dimerica SAE1/UBA2, l’unico enzima di coniugazione E2 Ubc9, multiple E3 ligasi e proteasi specifiche SUMO. Generalmente, il nascente proteine SUMO devono essere elaborati proteoliticamente per generare la forma matura. Il SUMO maturo è attivato dall’eterodimero E1 e quindi trasferita all’enzima E2 Ubc9. Infine, la glicina del C-terminale di SUMO covalenza è coniugata con la lisina di destinazione di un substrato, e questo processo è solitamente nei paraggi E3 ligasi. La proteina SUMO può essere rimosso dal substrato modificato da proteasi specifiche. Uno studio precedente dagli autori di questa carta ha rivelato che la sumoilazione di Rb aumenta suo legame con CDK2, che conduce alla fosforilazione di iper alla fase G1 precoce, un processo che è necessario per il ciclo cellulare progressione13. Inoltre abbiamo dimostrato che la perdita di Rb SUMOylation provoca una proliferazione delle cellule in diminuzione. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la sumoilazione di Rb protegge la proteina Rb da proteasomal fatturato, aumentando così il livello di proteina Rb in cellule19. Di conseguenza, sumolazione svolge un ruolo importante nella funzione di Rb in vari processi cellulari. Per studiare ulteriormente la conseguenza funzionale e rilevanza fisiologica di SUMOilazione Rb, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare lo stato SUMO di Rb in cellule o tessuti di pazienti umani.
Sumoilazione è un processo reversibile, altamente dinamico. Così, è solitamente difficile da rilevare le proteine SUMO-modificate in condizioni completamente endogene. Questo articolo presenta un metodo per rilevare endogeno Rb sumoilazione. Inoltre, viene illustrato come rilevare esogeno Rb sumoilazione di selvaggio-tipo Rb e sua mutazione di SUMO-carenti11. In particolare, Jacobs et al ha descritto un metodo per aumentare la modifica di SUMO di un substrato dato specificamente di Ubc9 fusion-regia SUMOylation (UFDS)20. Basato su questo metodo, questo protocollo viene descritto come analizzare la sumoilazione forzata di Rb e le sue conseguenze funzionali. Dato che centinaia di substrati SUMO è stati descritti precedentemente e più substrati putativi di SUMO sono stati identificati da molte analisi proteomica-based, questo protocollo può essere applicato per analizzare la SUMO-modifica di queste proteine in cellule umane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un protocollo per rilevare e analizzare la sumolazione endogeno di Rb in cellule umane. Mentre questo metodo è specificamente incentrato sulla proteina Rb endogena senza qualsiasi alternanza di segnale correlate a SUMO globale, è un importante strumento per lo studio di modificazione di Rb-SUMO in circostanze fisiologiche completamente naturali.
Per raggiungere questo obiettivo, è importante tenere a mente che: 1) anche se SUMO comprende quattro isoforme (SUMO1-4, c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dalla scienza e la tecnologia Commissione di Shanghai (Grant No. 14411961800) e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No. 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
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