Summary

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

Published: November 02, 2017
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Summary

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

포스트 번역 상 수정 단백질의 세포내 신호 변환의 적절 한 규제에 대 한 중요 하다. 이러한 수정 중 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 대상 단백질 유전자의 전사, DNA 수리, 단백질 세포질 과정 통제의 다양 한의 리 진 잔류물에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질은 상호 작용 저하, subcellular 전송 및 신호 변환. 표현과 재조합 태그 단백질 박테리아에는 체 외에서 생 화 확 적인 반응을 간단 하 고 기계적 주소 지정을 위해 적당 한 수의 정화를 기반으로 하는 단백질 SUMOylation 감지 하는 가장 일반적인 방법은 질문입니다. 그러나, vivo에서SUMOylation 과정의 복잡성 때문에 그것은 감지 하 고 분석 단백질 세포, 특히 생 조건에서 SUMOylation 더 도전. 이 문서의 저자에 의해 최근 연구 생 retinoblastoma (Rb) 단백질, 세포 주기 진행의 부정적인 규정 하는 중요 한 종양 억제기 초기 g 1 단계에서 특히 SUMOylated는 밝혔다. 이 종이 검출 및 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 Rb SUMOylation의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rb, 뿐만 아니라 많은 다른 스모 타겟 단백질, 인간 세포에서의 스모 수정 phenotypical 및 기능 조사에 적합 합니다.

Introduction

진 핵 세포에서 세포 주기 진행의 정확한 컨트롤을 특정 이벤트 정렬된 방식으로1,2자리 보장 꽉 규제 네트워크를 기반으로 합니다. 이 네트워크에서 핵심 선수 중 하나입니다 (Rb) retinoblastoma 단백질, 첫 번째 복제 종양 억제기1,3. Rb 단백질은 세포 주기 진행, 특히 S 단계 변화 및 종양 성장4,5G0/G1의 부정적인 레 귤 레이 터 라고 생각. Rb 함수 실패 하거나 직접 리드 어린이, 가장 일반적인 안구 내부 악성 retinoblastoma, 또는 많은 다른 유형의 암5의 개발에 기여 한다. 또한, Rb 세포 분화, chromatin 개장, 및 중재 하는 미토 콘 드리 아는 apoptosis3,,67를 포함 하 여 많은 세포질 통로에서 포함 된다.

포스트 번역 상 수정 RB 함수8,9의 규칙에 있는 중추적인 역할을 한다. 인 산화는 같은 한 수정, 그리고 그것은 일반적으로 Rb 비활성화 리드. 무부하 G0 셀에 Rb 인 산화 낮은 수준으로 활성화 됩니다. G0/G1 단계 진행 세포, Rb는 순차적으로 하이퍼-phosphorylated  종속 단백질 kinases (CDKs) 및 Rb를 비활성화 하 고 세포 주기를 억 누르기 위해 능력 제거   및 E/CDK2 D/CDK4/6, 같은 cyclins, 일련의에 의해 관련 유전자 식4,10. Rb 또한 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모)11,,1213수정 될 수 있습니다.

스모 다양 한 대상 단백질에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질 이다. 그것은 세포 주기 규칙을 포함 하 여 다양 한 세포질 프로세스에 대 한 중요, 전사, 단백질 세포질 지 방화 및 저하, 전송, 및 DNA 복구14,,1516, 17 , 18.에 스모 활용 통로로 구성 되어 dimeric 스모 E1 활성화 효소 SAE1/UBA2 단일 E2 conjugating 효소 Ubc9, 여러 E3 ligases, 스모 관련 프로 테아 제. 일반적으로, 초기 스모 단백질 proteolytically 성숙한 형태를 생성 하기 위해 처리 되어야 합니다. 성숙한 스모 E1 heterodimer에 의해 활성화 하 고 Ubc9 E2 효소로. 마지막으로, 스모의 C-터미널 글리신 covalently, 기판의 대상 리에 활용 된 그리고이 과정은 일반적으로 E3 ligases에 의해 촉진 된다. 스모 단백질 특정 프로 테아 제에 의해 수정 된 기판에서 제거할 수 있습니다. 이 문서의 저자에 의해 이전 연구 Rb SUMOylation CDK2에 그것의 바인딩을 초기 g 1 단계, 세포 주기 진행13에 필요한 과정에서 인 산화 하이퍼로 이어지는 증가 밝혀. 우리는 또한 Rb SUMOylation의 손실 감소 셀 확산 원인 설명 했다. 또한, 그것은 최근에 Rb의 SUMOylation proteasomal 회전율에서 따라서 셀19Rb 단백질의 수준을 증가 Rb 단백질을 보호 시연 했다. 따라서, SUMOylation 다양 한 세포질 프로세스에서 Rb 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 추가 연구를 기능 결과 Rb SUMOylation의 생리 적인 관련성 그건 인간의 세포 또는 환자 조직에서 Rb의 스모 상태를 분석 하는 효과적인 방법을 개발 하는 것이 중요.

SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정 이다입니다. 따라서, 완전히 생 조건에서 스모 수정 단백질을 검출 하기 위하여 일반적으로 어렵습니다. 이 종이 생 Rb SUMOylation 검색 하는 메서드를 제공 합니다. 또한, 그것은 야생-타입 Rb와 그 스모 결핍 돌연변이11외 인 Rb SUMOylation 감지 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 제이콥스 외. 주어진된 기판의 스모 수정 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD)20특히 증가 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에 따라,이 프로토콜은 Rb의 강제 SUMOylation 그리고 그것의 기능적인 결과 분석 하는 방법을 설명 합니다. 스모 기판의 수백 설명한가지고 있고 더 많은 putative 스모 기판 많은 proteomic 기반 분석 실험에서 확인 되었습니다,이 프로토콜 분석 인간 세포에이 단백질의 SUMO 수정에 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 탐지의 내 생 Rb SUMOylation 초기 g 1 단계에서 문화 및 세포 주기 동기화 셀. 유지 HEK293 세포 성장 매체를 포함 하는 Dulbecco에서 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 1% 펜 Strep 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO 2 보충. G0 단계에서 HEK293 세포를 동기화합니다. HEK293 세포 15 cm에서 hemocytometer와 씨 ~1.5 x 10 7 셀을 사용 하 여 치료 전에…

Representative Results

세포 주기 진행 하는 동안 내 생 Rb SUMOylation 감지,이 연구 처음 동기화 HEK293 세포 세포 주기 (G0, 초기 G1, G1, S, 및 G2/M)의 5 개의 다른 단계에서이 문서의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로. 동기화의 품질 propidium 요오드 화물 흐름 cytometry 분석 (그림 1) 다음으로 핵 산 얼룩을 사용 하 여 확인 되었다. 다음으로, 셀 수집 되었고 RIPA 버퍼를 변성 시키기 의해 ly…

Discussion

이 종이 감지 하 여 인간의 세포에 Rb 생 SUMOylation 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 특히 글로벌 스모 관련 신호의 어떤 교체 없이 생 Rb 단백질에 초점이, Rb 스모 수정 완전히 자연 생리 상황 조사를 위한 중요 한 도구입니다.

이 목표를 달성 하기 위해, 그것은 마음에 유지 하는 것이 중요 하는: 1) 스모는 ubiquitination에 비해 4 개의 isoforms (SUMO1-4, 각각 서로 다른 유전자에 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 과학 및 기술 위원회 상하이 (보조금 번호 14411961800)와 국가 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81300805)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM  Thermo Fisher Scientific 31985070
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Thymidine Sigma T9250
Nocodazole Sigma M1404
propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Triton X-100  AMRESCO 694
RNase A  Thermo Fisher Scientific EN0531
N-Ethylmaleimide Sigma E3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) AMRESCO M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40) AMRESCO M158
protease inhibitor Roche 5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Rb antibody Cell Signaling Technology #9309
Protein A/G-Sepharose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
Lipofectamine-2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads Qiagen 30230
Imidazole Sigma I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel BIO-RAD 4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Millipore IPVH00010
Tween-20 AMRESCO M147
Tubulin antibody Abmart M30109
SUMO1 antibody Thermo Fisher Scientific 33-2044
GFP antibody Abmart M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories 715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit Thermo Fisher Scientific 32106

References

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Cite This Article
Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).

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