В естественных условиях Обнаружение и анализ SUMOylation белка Rb в клетках человека
Summary
Маленький убиквитин связанных модификатор (сумо) семьи белки конъюгированных остатков лизина целевых белков для регулирования различных клеточных процессов в. Этот документ описывает протокол для обнаружения ретинобластомы (Rb) белка SUMOylation условиях эндогенных и экзогенных в клетках человека.
Abstract
Столб-поступательные изменения белки имеют решающее значение для надлежащего регулирования внутриклеточного сигнала. Среди этих изменений маленький убиквитин связанных модификатор (сумо) — убиквитин как белок, который придается ковалентно остатков лизина целого ряда белков-мишеней для регулирования клеточных процессов, таких как транскрипции гена, репарации ДНК, белки взаимодействие и деградации, субцеллюлярные транспорта и передачи сигнала. Наиболее распространенный подход к выявлению белка SUMOylation основан на выражение и очистки тегами рекомбинантных белков в бактериях, позволяющие в vitro биохимические реакции, которая проста и подходит для адресации механистический вопросы. Однако из-за сложности процесса SUMOylation в естественных условиях, это более сложно обнаружить и проанализировать белка SUMOylation в клетках, особенно когда в местных условиях. В недавнем исследовании авторы этого документа показал, что белок эндогенного ретинобластомы (Rb), супрессора опухолевого роста, что является жизненно важным для отрицательных регуляции клеточного цикла прогрессии, специально SUMOylated в ранней фазе G1. Этот документ описывает протокол для обнаружения и анализа РБ SUMOylation условиях эндогенных и экзогенных в клетках человека. Этот протокол является подходящим для Фенотипические и функциональные исследования сумо модификация РБ, а также многих других сумо целевых белков, в клетках человека.
Introduction
Точный контроль клеточного цикла прогрессии в эукариотических клетках основан на жесткой регулирования сети, которая гарантирует, что конкретного события происходят в упорядоченной форме1,2. Одним из ключевых игроков в этой сети является белка ретинобластомы (Rb), первый клонированный опухоли подавитель1,3. Считается, что белка Rb негативный регулятор клеточного цикла прогрессии, особенно для G0/G1 S фазового перехода, и опухоль роста4,5. Неспособность РБ функции либо непосредственно приводит к наиболее распространенных злокачественных внутриглазных в детей, ретинобластома, или способствует развитию многих других видов рака5. Кроме того Rb участвует в многих клеточных пути, включая дифференцировки клеток, chromatin remodeling и апоптоз, митохондрии опосредованной3,6,7.
Столб-поступательные изменения играют ключевую роль в регуляции RB функция8,9. Фосфорилирование является одной такой модификации, и это обычно приводит к инактивации РБ. В неработающем G0 клеток Rb активен с уровнем низких фосфорилирования. Как клетки прогресс через G0/G1 фазе, Rb, последовательно гипер фосфорилированных ряд белков циклин зависимых киназ (CDKs) и циклинов, например циклин E/CDK2 и циклин D/CDK4/6, который инактивирует РБ и устранить ее способность подавлять клеточный цикл связанные с генной выражение4,10. RB также может быть изменен маленький убиквитин связанных модификатор (сумо)11,12,13.
Сумо это убиквитин как белок, который ковалентно придается ряд белков-мишеней. Это важно для различных клеточных процессах, включая регуляции клеточного цикла, транскрипция, белка клеточной локализации и деградации, транспорта и ДНК ремонт14,,1516, 17 , 18. спряжение путь сумо состоит из димерной сумо E1 активации фермента SAE1/UBA2, единого E2 спрягать фермента Ubc9, несколько ligases E3 и сумо конкретных протеаз. Как правило должны обрабатываться зарождающейся сумо белки proteolytically для создания Зрелые формы. Зрелые сумо активированную гетеродимера E1 и затем передана фермента E2 Ubc9. Наконец C-терминал глицин сумо ковалентно конъюгированных для целевого лизин субстрата, и этот процесс обычно способствует E3 ligases. СУМО белка могут быть удалены из модифицированных субстрата конкретных протеаз. Предыдущего исследования, авторы этого документа показали, что SUMOylation РБ увеличивает его привязки к CDK2, ведущих к гипер фосфорилирования в ранней фазе G1, процесс, который необходим для клеточного цикла прогрессии13. Мы также показали, что потеря РБ SUMOylation вызывает снижение пролиферации. Кроме того было недавно продемонстрировано, что SUMOylation РБ защищает белка Rb от протеосомной оборот, тем самым увеличивая уровень белка Rb в клетках19. Таким образом SUMOylation играет важную роль в РБ функции в различных клеточных процессах. Для дальнейшего изучения, функциональным последствием и физиологической значимости РБ SUMOylation, важно разработать эффективный метод для анализа состояния сумо РБ в человеческих клеток или тканей пациента.
SUMOylation является обратимой, высоко динамичный процесс. Таким образом обычно трудно обнаружить сумо модифицированные белки полностью эндогенного условиях. Этот документ представлен метод обнаружения эндогенного РБ SUMOylation. Кроме того он показывает, как обнаруживать экзогенных SUMOylation РБ одичал типа Rb и его сумо недостаточным мутации11. В частности Jacobs et al. описал метод для увеличения сумо модификации данного субстрата конкретно на Ubc9 направленного синтеза SUMOylation (Рассматриваемое)20. На основе этого метода, этот протокол описывает как анализировать принудительного SUMOylation РБ и ее функциональных последствий. Учитывая, что сотни субстратов сумо были описаны ранее, и было выявлено более предполагаемый сумо субстратов из многих на основе протеомных анализов, этот протокол может применяться для анализа сумо модификация этих белков в клетках человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот документ описывает протокол обнаружения и анализа эндогенных SUMOylation Rb в клетках человека. Как этот метод специально ориентирована на эндогенного белка Rb без каких-либо чередование глобальной связанных с сумо сигнала, он является важным инструментом для расследования Rb-сумо модиф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантов от науки и техники Шанхая Комиссии (Грант № 14411961800) и Национальный фонд естественных наук Китая (Грант № 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
