Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging
Summary
Il trasparente c. elegans intestino può servire come una“nel vivo del tessuto camera” per lo studio della biogenesi di membrana e lume di apicobasal a livello di singola cellula e subcellulare durante tubulogenesis multicellulari. Questo protocollo viene descritto come combinare etichettatura standard, perdita di funzione genetica/RNAi e approcci al microscopio dissezionare questi processi a livello molecolare.
Abstract
Multicellulari tubi, unità fondamentali degli organi interni, sono composti da cellule endoteliali o epiteliali polarizzate, con membrane apicali che rivestono le membrane lumen e basolaterale contattando reciprocamente e/o la matrice extracellulare. Come questa asimmetria di membrana distintivo è stabilita e mantenuta durante la morfogenesi dell’organo è ancora una questione irrisolta della biologia delle cellule. Questo protocollo descrive l’intestino di c. elegans come un modello per l’analisi della biogenesi della membrana polarizzata durante la morfogenesi del tubo, con enfasi sulla biogenesi di lumen e membrana apicale. C. elegans venti celle singolo-stratificato epitelio intestinale è organizzato in un semplice tubo bilateralmente simmetrico, permettendo l’analisi a livello di singola cellula. Polarizzazione di membrana si verifica in concomitanza con polarizzato la divisione cellulare e la migrazione durante l’embriogenesi precoce, ma de novo polarizzati biogenesi della membrana continua in tutto la crescita larvale, quando le cellule non proliferano e spostare. L’impostazione di quest’ultimo consente di separare cambiamenti sottocellulari che contemporaneamente mediano questi diversi processi di polarizzazione, difficili distinguere nella maggior parte dei modelli di polarità. Apicale-, basolaterale della membrana-, giunzionale-, del citoscheletro- ed endomembrane componenti possono essere etichettati e monitorati durante lo sviluppo di proteine di fusione di GFP o valutati da in situ dell’anticorpo che macchia. Insieme versatilità genetica dell’organismo, l’intestino di c. elegans fornisce così un modello unico in vivo per l’oggetto visual, inerente allo sviluppo e l’analisi genetica molecolare della membrana polarizzata e biogenesi di tubo. I metodi specifici (tutti gli standard) descritti qui includono come: etichetta componenti sottocellulari intestinale dalla macchiatura dell’anticorpo; analizzare i geni coinvolti nella biogenesi della membrana polarizzata da studi di perdita-de-funzione adattati ai geni essenziali in genere tubulogenesis; valutare i difetti di polarità durante varie fasi di sviluppo; interpretare i fenotipi di epifluorescenza, contrasto differenziale di interferenza (DIC) e microscopia confocale; quantificare i difetti visivi. Questo protocollo può essere adattato per analizzare qualsiasi delle molecole coinvolte spesso altamente conservate in polarità epiteliale, la biogenesi della membrana, morfogenesi tubo e lume.
Introduction
La generazione delle asimmetrie cellulare e subcellulare, quali la formazione di domini di membrana polarizzata, è cruciale per la morfogenesi e la funzione di cellule, tessuti ed organi1. Gli studi sulla biogenesi della membrana polarizzata negli epiteli rimangono una sfida tecnica, dato che i cambi di direzione nella ripartizione dei componenti sottocellulari dipendono più consecutivi e coincidenti segnali extracellulari ed intracellulari che sono difficili da separare nella maggior parte dei modelli e dipendono fortemente dal sistema modello. Il modello presentato qui – singolo-stratificato Caenorhabditis elegans intestino – è un tessuto di squisita semplicità. Insieme con la singola cellula c. elegans escretore canal (Vedi carta di accompagnamento sulla biogenesi della membrana polarizzata nel canale escretore c. elegans )2, offre diversi vantaggi unici per l’identificazione e caratterizzazione di molecole necessarie per la biogenesi della membrana polarizzata. La conservazione delle stecche di polarità molecolare dal lievito all’uomo rendono questo semplice organo invertebrati marini un eccellente“in vivo camera tessuto” per rispondere alle domande sulla polarità epiteliale che hanno rilevanza diretta per il sistema umano, che è ancora troppo complesso per permettere la dissezione visiva di questi eventi presso il singolo livello in vivodi cellule.
Anche se più segnali di polarità conservate da (1) la matrice di extracelluar, (2) la membrana plasmatica e suoi incroci e traffico vescicolare dei suini (3) intracellulare sono stati identificati3, i principi della loro integrazione nel processo di polarizzata biogenesi della membrana ed il tessuto epiteliale è capita male4. I modelli di cella singola classica in vivo (e.g.s. cerevisiae e lo zigote di c. elegans ) sono stati strumentali nel definire i principi di divisione delle cellule polarizzata e polarità antero-posteriore e hanno identificato critici membrana-collegato polarità determinanti (piccole GTPasi/CDC-42, la PARs di partizionamento difettosi)5,6, ma essi dipendono dalla rottura cues (bud cicatrice, voce di sperma) unico di simmetria e mancanza di giunzione-assicurato domini di membrana apicobasal e, presumibilmente, il corrispondente apicobasal intracellulare ordinamento macchinari. Nostre conoscenze attuali circa l’organizzazione del traffico polarizzato di epiteli, tuttavia, si basa principalmente su mammiferi monocolture 2D7, che mancano spunti extracellulare ed inerenti allo sviluppo fisiologici che possono cambiare le posizioni della membrana domini e le direzioni di traffico traiettorie (passaggio dal 2D al 3D in vitro sistemi di coltura da solo è sufficiente per invertire la polarità della membrana in cellule MDCK (rene canino Madin-Darby))8. In vivo studi evolutivi sulla polarità epiteliale in organismi invertebrati marini modello inizialmente sono stati condotti negli epiteli piatti, per esempio nell’epidermide Drosophila melanogaster , dove hanno identificato il contributo critico delle dinamiche di giunzione per migrazione delle cellule polarizzate e cella foglio movimento9e del traffico endocitico per polarità manutenzione10. Il 3D in vitro e in vivo l’analisi della morfogenesi lumen in epiteli tubolare in cellule MDCK e nell’intestino di c. elegans , rispettivamente, hanno recentemente identificato il requisito del traffico intracellulare per de Novo dominio (apicale) e biogenesi di lumen e posizionamento11,12,13. Lo spessore del tubolare (rispetto al piatto) cellule epiteliali è un vantaggio per l’analisi 3D delle asimmetrie subcellulare poiché consente una distinzione visiva superiore della membrana apicale lumenal, giunzioni apico-laterale, la membrana laterale e la posizioni di organelli intracellulari. A questi vantaggi di visual, il modello di c. elegans aggiunge l’impostazione in vivo , asse inerente allo sviluppo, trasparenza, semplicità del piano corporeo, stirpe delle cellule invarianti e definito, analitica (genetica) e ulteriori vantaggi descritti di seguito.
C. elegans stessa è un verme di struttura tubolare cui trasparenza e semplice architettura fanno gli organi interni allo stesso modo tubolari direttamente accessibile all’analisi visiva della morfogenesi tubo e lume. Le venti cellule del suo intestino (21 o 22 cellule in occasione)14 sono derivate da una cellula progenitrice singola (E) e si sviluppano da un epitelio a doppio strato da un passo di intercalazione in una provetta bilateralmente simmetrico di nove anelli di INT (quattro cellule nella primo anello; Figura 1 schema)14,15,16. Analisi di lignaggio e tessuto dell’intestino, inizialmente determinata dall’ottica di Nomarski via nucleare identità17e successivamente da microscopia di fluorescenza tramite membrane con etichettate, ha fornito le comprensioni critiche nella sua morfogenesi, in particolare i requisiti autonoma delle cellule e cellula-non autonomi per le sue divisioni cellulari direzionale e movimenti (ad esempio, intercalazione, asimmetrie destra-sinistra, rotazione tubo anteriore e posteriore)14,18 . La rete di regolamentazione gene controllo dello sviluppo di questo organo di modello clonale e precoce delle cellule endodermiche specifiche sono ben caratterizzati19,20. Il fuoco qui, tuttavia, è l’analisi della membrana polarizzata e biogenesi lumen in singole cellule tubolari e delle asimmetrie intracellulare di livello delle endomembrane, strutture citoscheletriche e organelli che accompagnano questo processo. L’analisi è facilitata dalla semplicità di questo tubo, dove tutte le membrane apicali (il livello ultrastrutturale distinto da microvilli) affrontano il lume e tutte le membrane basali faccia la superficie del tubo esterno, con membrane laterali tocchino, separati dalla membrana apicale dalle giunzioni (Figura 1 schema; Vedi riferimenti (16,21) per il c. elegans-specifica organizzazione di stretto e componenti di giunzione dei adherens). Biogenesi della membrana apicale è così coincida con la morfogenesi di lumen. Inoltre, la dimensione delle cellule intestinali adulte – le cellule più grande di questo piccolo animale (con eccezione della cella escretore) – approssimativa di una cellula di mammiferi, permettendo il tracking visivo in vivo degli elementi subcellulari, ad es. traiettorie della vescicola, che in genere è tentarono in vitro in una piastra di coltura.
Ai fini di questa analisi cellulare e subcellulare, etichettatura appropriata è fondamentale. Domini di membrana di endo intestinale o di plasma, giunzioni, del citoscheletrostrutture, nuclei e altri organelli subcellulari possono essere visualizzate da loro componenti molecolari specifiche di etichettatura. Molti tali componenti sono stati caratterizzati e continuano ad essere scoperti (tabella 1 dà alcuni esempi e si riferisce alle risorse). Per esempio, varie molecole distinguendo i compartimenti vescicolari e/o tubolari del sistema di endomembrane intestinale, da ER Golgi via vescicole post-Golgi alla membrana del plasma, sono state individuate22. Le specifiche proteine (così come lipidi e zuccheri) possono essere etichettati o direttamente, o indirettamente tramite proteine leganti. Questo protocollo si concentra su in situ macchiatura dell’anticorpo di campioni fissati, una delle due tecniche di etichettatura standard (Vedi il documento di accompagnamento il canale escretore tubulogenesis per una descrizione degli altri tecnica2 – etichettatura in vivo tramite fusioni di proteina fluorescente – che è direttamente applicabile all’intestino; Tabella 2 fornisce esempi di promotori specifici dell’intestino che possono essere utilizzati per guidare l’espressione di queste proteine di fusione nell’intestino). Doppio – o più etichettatura con entrambi gli approcci, o con una combinazione di entrambi plus aggiuntivi chimici macchiatura, permette una maggiore risoluzione visiva approfondita e l’esame delle variazioni spaziali e temporali in co-localizzazione e assunzione di specifici molecole o dei componenti subcellulari (Figura 2). La fissazione e la macchiatura le procedure descritte in questa conservazione del supporto di protocollo della proteina fluorescente verde (GFP) etichettatura durante le procedure di immunostaining. Per l’imaging, i punti di rilevamento chiave e caratterizzazione di tubulogenesis fenotipi tramite procedure standard microscopiche (dissezione e confocale microscopia a fluorescenza) sono descritti (Figura 3, 4). Questi può essere esteso a risoluzione più alta imaging approcci, per istanza superresolution microscopia e trasmissione microscopia elettronica (non descritto qui).
Un punto di forza di questo sistema è la capacità di analizzare la polarità in singole cellule a diversi stadi di sviluppo, da embriogenesi fino all’età adulta. Per esempio, biogenesi di dominio e lume di membrana apicale può essere rintracciata nel corso dello sviluppo a livello di singola cellula tramite etichettatura con ERM-1, un linker membrana altamente conservato-actina della famiglia di ezrina-radixina-moesina23,24 . ERM-1 Visualizza la biogenesi della membrana apicale (1) durante la morfogenesi embrionale tubo, quando essa si verifica in concomitanza con polarizzata divisione cellulare e la migrazione (cellule mossa apically intorno il lume durante intercalazione)15; (2) durante il tardo embrionale e larvale tubo di prolunga che procede in assenza di divisione cellulare o migrazione; e (3) nell’intestino adulto, dove domini di membrana polarizzata sono mantenuti (Figura 1). Nell’espansione post-mitotico epitelio larvale, de novo polarizzati membrana biogenesi così può essere separata dalla morfogenesi del tessuto polarizzati, che non è possibile nella maggior parte dei modelli di polarità epiteliale in vivo e in vitro , compresi quelli con cella singola ad alta risoluzione (ad esempio il 3D MDCK ciste modello8). Con l’etichettatura per altri componenti, questa impostazione fornisce la possibilità (soprattutto allo stadio larvale L1 quando le cellule hanno un più alto rapporto nucleo/citoplasma) per distinguere quei cambiamenti intracellulari che sono specifici per polarizzati (biogenesi della membrana per esempio il riorientamento delle traiettorie traffico) da quelli richiesti simultaneamente per divisione delle cellule polarizzata e migrazione.
La versatilità genetica dei elegans del c. è ben noto25e lo rende un sistema potente modello per l’analisi molecolare di qualsiasi domanda biologica. Uno studio sulla morfogenesi, per esempio, puoi iniziare con un ceppo selvaggio-tipo, un ceppo transgenico dove la struttura di interesse (ad es. una membrana) è etichettata con un marcatore fluorescente, o con un mutante di perdita o guadagno di funzione con un difetto in questo struttura. Un tipico studio di genetico inverso potrebbe generare un mutante dove viene eliminato il gene di interesse in linea germinale (ad es. tramite un’omissione mirata), modificata da mutagenesi (che in genere producono mutazioni puntiformi con conseguente perdita, riduzione o aumento di funzione del gene), o dove la sua trascrizione è ridotto di RNAi. La facilità di RNAi di alimentazione in c. elegans26 si presta anche alla progettazione di schermi mirati che esaminano un gruppo più numeroso di geni di interesse. Senza dubbio più grande forza dell’organismo un modello genetico è la capacità di condurre in vivo avanti schermi (ad es. mutagenesi, schermi RNAi sistematici o genoma) che consentono un’inchiesta imparziale la causa molecolare per un fenotipo di interesse. Per esempio, un imparziale visual c. elegans RNAi tubulogenesis schermo, a partire con un animale transgenico con membrane apicali ERM-1-labeled, scoperto un intrigante polarità intestinale reversibile conversione e fenotipo ectopico lumen, usato qui come esempio per questo tipo di analisi. Questa schermata identificato lo svuotamento di glicosfingolipidi (GSLs; lipidi di membrana obbligano, identificati tramite loro enzimi biosintetici GLS) e componenti della vescicola cappotto clatrina e relativo adattatore AP-1 come i difetti molecolari specifici che causano questa polarità fenotipo di conversione, quindi che caratterizzano questi traffici molecole come in vivo spunti per la polarità della membrana apicale e lume posizionamento12,13. Quando si inizia con un fenotipo specifico mutazione genetica/morfogenesi, tali schermi (o esperimenti di singola interazione genetica/RNAi) possono essere analizzati anche interazioni funzionali tra due o più geni di interesse (Vedi che accompagna il libro sull’escretore canale per un esempio di tale analisi)2. Questo protocollo si concentra su RNAi che, oltre alla sua capacità di identificare direttamente il gene cui perdita causa il fenotipo in avanti schermi, offre vantaggi specifici per l’analisi della morfogenesi. Poiché prodotti genici dirigere morfogenesi spesso funzionano ad un modo dipendente dalla dose, RNAi è solito successo nel generare uno spettro di fenotipi. La capacità di generare informativi parziale-perdita-de-funzione fenotipi aiuta anche ad per affrontare il problema che la maggior parte dei geni importanti tubulogenesis è essenziale e che le loro perdite causano sterilità e mortalità embrionale precoce. Questo protocollo comprende condizionale RNAi strategie per superare questa difficoltà e suggerisce modi per ottimizzare la generazione di un più ampio spettro di fenotipi, come ad esempio una serie allelica prodotta mediante mutagenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo viene descritto come combinare standard perdita di funzione genetica/RNAi e imaging (etichettatura e microscopici) approcci per sfruttare l’epitelio intestinale di c. elegans come un modello per l’analisi visiva e molecolare della in vivo polarizzata biogenesi della membrana e lume.
Etichettatura
Questo protocollo si concentra sulla macchiatura dell’anticorpo. In situ etichettatura dagli anticorpi è un a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia Mario de Bono (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Parigi, Francia), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Francia) e le CGC, finanziato dall’ufficio di NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440), per i ceppi e gli anticorpi. Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM078653, MGH è 224570 e SAA 223809 a V.G.
Materials
| Antibody staining | |||
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Tween | Fisher Scientific | 50-213-612 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Powdered milk | Sigma | MT409-1BTL | |
| Primary antibodies | |||
| MH27 (mouse) | Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| MH33 (mouse) | Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| anti-ICB4 (rabbit) | Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England) | ||
| anti-PAR-3 (rabbit) | Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University) | ||
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Floor 568 (anti-rabbit) | ABCam | AB175471 | Concentration: 1:200 |
| Cy5 (anti-mouse) | Life technologies | A10524 | Concentration: 1:200 |
| TRITC (anti-rabbit) | Invitrogen | T2769 | Concentration: 1:200 |
| FITC (anti-mouse) | Sigma | F9006 | Concentration: 1:100 |
| Labeled chemicals | |||
| Texas Red-Phalloidin | Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471 | ||
| Materials | |||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 4448 | |
| Microscope coverslips (22×22-1) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| C. elegans related | see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures. | ||
| LB Medium and plates | see reference29 for protocols. | ||
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| Ampicillin | Sigma | A0116 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912 | |
| M9 Medium | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| NGM plates | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| RNAi plates | see reference30 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| IPTG | US Biological | I8500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | 50371500 | |
| Bacteria | |||
| OP50 bacteria | CGC | ||
| HT115 bacteria | CGC | ||
| Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) | Source BioScience | ||
| Imaging related | |||
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP9221-500 | |
| Equipment | |||
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-U | |
| dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) | Olympus | SZX12 | |
| Laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystem | TCS SL | |
| laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope | Nikon | C2 |
References
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