細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング
Summary
透明な線虫の腸、「体内組織商工会議所「多細胞 tubulogenesis の中に apicobasal の膜と内腔の生合成単一セルおよび細胞内レベルでの勉強のためとして使用できます。このプロトコルでは、分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ、機能喪失遺伝的/RNAi 標準ラベルを結合する方法をについて説明します。
Abstract
多管、すべての内部器官の基本単位は、互いおよび/または細胞外マトリックスへのお問い合わせルーメンと基底膜の内側を覆う細胞膜と偏光の上皮や内皮細胞で構成されます。この特徴的な膜の非対称性を確立・器官形成の間に維持する方法はまだ細胞生物学の未解決の質問です。このプロトコルでは、頂端膜と内腔形成に重点を置いて、管の形成の間に偏光膜生合成の解析のためのモデルとして線虫腸をについて説明します。20 セル線虫 c. エレガンス一層腸上皮は単一セルのレベルの分析を許可する単純な左右相称なチューブに整理されます。偏光膜は付随して偏光の細胞分裂と初期胚発生がde novo偏極移行で発生します、もはや増殖し、移動する細胞膜器官が幼虫の成長を通して継続します。後者の設定では、同時にこれらのほとんどの極性モデルを区別することは困難異なる偏光プロセスを仲介する細胞の変化を分離することができます。頂、基底膜-、接合部-細胞骨格、-内コンポーネントのラベルし GFP の融合蛋白質によって開発全体を通して追跡かその場で抗体の汚損によって評価。一緒に生物の遺伝的多様性、 c. の elegans腸はこうして視覚、発達、ユニークな体内モデルと偏光膜および管器官の遺伝子解析を提供します。ここで説明した特定のメソッド (すべての標準) を含める方法: 抗体の汚損; 腸細胞レベル下のコンポーネントにラベルを付ける通常重要な tubulogenesis の遺伝子に適応した機能喪失研究によって偏光膜生合成に関与する遺伝子を解析します。極性; さまざまな発達段階で欠陥を評価します。落射蛍光、差動干渉の対照 (DIC)、共焦点顕微鏡による表現型を解釈します。視覚的な欠陥を定量化します。このプロトコルは、上皮細胞極性、膜器官、管および内腔の形態形成に関与する多くの場合非常に節約された分子のいずれかを分析に適応することができます。
Introduction
細胞と細胞の非対称性、偏光膜ドメイン形成などの発生は形態形成と細胞、組織、器官1の機能にとって重要です。複数連続して一致する細胞外および細胞内シグナルに依存して細胞レベル下のコンポーネント割り当ての方向変化以来、技術的な課題のまま上皮における偏光膜生合成に関する研究ほとんどのモデルの分離し、モデル システムに強く依存することは困難。モデル紹介 – 単層線虫腸 – 絶妙なシンプルさの組織であります。単一セルと一緒にc. の elegans排泄運河 ( c. の elegansの排泄管の偏光膜生合成紙に同行を参照)2、身分証明書のいくつかのユニークな利点を提供し、偏光膜生合成に必要な分子の性格描写。男に酵母から分子極性手がかりの保全するこの単純な無脊椎動物オルガン優れた「生体内で組織の部屋」はまだあまり人間のシステムに直接関係のある上皮細胞極性に関する質問を解決するシングルでこれらのイベントのビジュアル解剖を許可する複雑な細胞レベルの生体です。
複数保存されている極性 (1) などの細胞外マトリックスから手がかりを (2) 細胞膜および接合、および (3) 細胞内小胞輸送がされて識別された3の過程において彼らの統合の基本原則偏光上皮膜と組織器官はかり4です。(E.g.S. 酵母と線虫受精卵) の生体内で古典的な単一細胞モデル偏光セル分割前後極性の原理を定義することに尽力しているし、重要な識別しました。膜の極性決定要因 (小低分子量 g 蛋白質/CDC-42、分割不良パルス)5,6, しかし、彼らユニークな対称性の破れ (芽傷、精子のエントリ) の手がかりに依存しており、接点保護を欠いています。apicobasal 膜ドメインと、おそらく、機械をソート対応する細胞内 apicobasal。偏光上皮、人身売買の組織について我々 の現在の知識ただし、主に依存している哺乳類の 2D モノカルチャー7膜の位置を変更できる生理的細胞外および発達の合図を欠いています。ドメインおよび人身売買軌跡の方向 (2 D から 3 Dの in vitro培養系単独への切り替えは (マディン-ダービー犬腎臓) MDCK 細胞の膜の極性を反転するのには十分である)8。無脊椎動物モデルで上皮細胞の極性に関する発達研究生体内をフラット上皮、例えば、彼らは重要な貢献を認識、キイロショウジョウバエ表皮で最初行った偏光細胞遊走と細胞シートの動き9、ジャンクション ダイナミクスとエンドサイトーシスの極性メンテナンス10の人身売買。3 D体外と体内の MDCK 細胞とc. の elegansの腸、尿細管上皮細胞の内腔の形態形成解析, 最近識別したドの細胞内輸送の要件novo (尖) ドメインと腔器官および11,12,13を位置決めします。厚みの鋼管 (フラット) 対上皮細胞は細胞の非対称性の 3次元解析のための利点それは内腔側のアピカル膜、切端側接合、外側の膜の優れた視覚的に区別を可能にするので、細胞内小器官の位置。これらの視覚の利点に線虫モデル追加の体外、発達軸、透明性、ボディ計画、インバリアントと定義された細胞系譜、分析の単純化 (遺伝) と以下の付加的な利点。
線虫自体は、その透明性と単純なアーキテクチャを作る同様に管状の臓器管と内腔の形態の視覚的分析に直接アクセスできる管状構造の回虫です。その腸 (21 または 22 セル時々)14の 20 セル単一前駆細胞 (E) から派生するため 9 INT リングの左右相称なチューブにインターカレーション一歩二層上皮から開発 (細胞の 4 つ、最初のリング;図 1概略)14,,1516。腸の系列と組織分析、核アイデンティティ17を介してノマルスキー光学およびその後ラベルの付いた膜を介して蛍光顕微鏡最初によって決まりますがその形態形成に重要な洞察力を提供します。特定方向の細胞分裂の動き (例えばインターカレーション、左右非対称、前部と後部のチューブ回転)14,18 細胞自律的および細胞非自律的要件.初期の内胚葉細胞の仕様、このクローン モデル器官の開発を制御する遺伝子調節ネットワークよく特徴付けられて19,20.ここでは、フォーカスはただし、単一の尿細管細胞の偏光膜と内腔の膜、細胞骨格構造、このプロセスに伴う細胞内小器官の細胞の非対称性の解析です。分析はどこ (微細構造レベルの微絨毛によって区別) のすべて頂端膜内腔に直面し、すべての基底膜直面アウター チューブ表面膜互いに接触、このチューブのシンプルさによって促進されます。接合による管腔膜から分離 (図 1の模式図; c. の elegansの参照参照 (16,21)-タイトの所属する組織や単接合部品)。頂側膜器官、内腔の形態と同一です。さらに、成人腸細胞 – この小動物の (を除く排泄セル) の最大細胞 – のサイズおおよその細胞の要素、例えば体内視標追跡を許可する哺乳類のセルのサイズ通常は小胞の軌跡は体外培養皿にしようとしました。
この細胞と細胞内局在の解析を目的として、適切なラベルを付けることは重要です。腸の遠藤やプラズマ膜ドメイン、接合、細胞骨格構造, 核とその他の細胞小器官は、その特定分子コンポーネントのラベル化による視覚化できます。このような多くのコンポーネント、特徴づけられているそして発見される続けます (表 1いくつかの例を与えるし、リソースを参照)。例えば、細胞膜にポスト ゴルジ小胞を介してゴルジに ER と腸内システムの鋼管および/または小胞のコンパートメントを区別する様々 な分子は、識別された22をされています。特定蛋白質 (と同様、脂質、糖質) どちらかラベル付けできますが、直接または間接的結合蛋白質を介して。このプロトコルはその場で抗体染色固定標本は、2 つの標準的な分類の技術の 1 つに焦点を当てて (排泄管 tubulogenesis 他手法の2 – の説明のために付属の紙を見る体内標識蛍光タンパク質融合 – 経由; 腸に直接適用されます。テーブル2の例を示します腸管特異的発現プロモーター腸へのような融合蛋白質の表現をドライブするために使用できます)。ダブル複数分類のどちらの方法でも両方プラス追加化学染色の組み合わせ、または、詳細な視覚解像度を大きくとの共局在の時空間変化の検討し、特定の募集分子や細胞レベル下のコンポーネント (図 2)。固定と染色免疫染色手順中に表示緑色蛍光タンパク質 (GFP) のこのプロトコル サポートの保存で説明されている手順。イメージングのための検出のポイントし、標準的な顕微鏡手順 (蛍光性解離性と共焦点顕微鏡) 経由で表現型が tubulogenesis の特性説明(図 3, 4)。これらより高い解像度 (ここでは説明しません) インスタンス, 高分解能顕微鏡および透過電子顕微鏡のためのアプローチをイメージングする拡張できます。
キーの強さがこのシステムは、成人期を通じて胚から、さまざまな発達段階で個々 の細胞の極性を分析する能力です。ERM – 1、エズリン ラデキシン モエシン家族23,24 の非常に節約された膜アクチン リンカー ラベルを介して単一セルのレベルで開発中アピカル膜ドメインと腔器官を追跡ことができますたとえば、.ERM 1 は、胚管形成時に頂端膜器官 (1) を視覚化する偏光の細胞分裂と移行 (頂角インターカレーション中ルーメン周辺細胞移動)15; 付随して発生したとき(2) 細胞分裂または移行の不在で進む後半の胚および幼生管延長中(3) 偏光膜ドメインが (図 1) を維持、成人の腸管で。拡大の後分裂幼虫上皮におけるde novo偏光膜器官はほとんど体内と体外の上皮細胞極性モデルでは不可能です、偏光組織の形態形成からこうして分けることが単一セルの解像度 (例: 3 D MDCK 嚢胞モデル8) を含みます。この設定は他のコンポーネントの表示、(特に、L1 幼虫の段階で細胞が細胞質・核の比率が高い) 機会を提供しますに固有のこれらの細胞内の変更を区別するために偏光膜器官 (例えば人身売買の軌道の向きかえ) 偏光の細胞分裂と移行に必要な付随してそれらから。
線虫の遺伝的多様性はよく知られている25です、任意の生物学的問題の分子分析のための強力なモデル システムになります。形態形成に関する研究、例えば、野生型株、蛍光マーカーやこの欠陥または利得の-機能喪失変異体興味 (例えば膜) の構造がラベル付けされて形質転換株を始めることができます。構造体です。典型的な逆遺伝学的研究 (通常生産関数の利得や削減、結果の損失と点突然変異の突然変異誘発によって変更 (例:ターゲットの削除によって)、生殖興味の遺伝子の削除、突然変異を生成するかもしれません遺伝子) の RNAi によりその成績証明書を削減または。RNAi のc. の elegans26で供給することにより使いやすさは、興味の遺伝子の大規模なグループを調べる対象となる画面のデザインにも適しています。遺伝モデル有機体の間違いなく最大の強みは生体内で前方の画面 (例えば突然変異、組織的または全ゲノム RNAi 画面) の表現型の分子原因に対する公平な調査を許可するを実施する能力関心します。公平なビジュアルでは例えば、RNAi線虫tubulogenesis 画面で、ERM 1 ラベル頂端膜、遺伝子組換え動物から始まる魅力的な可逆的腸管極性変換と異所性内腔表現型、使用を発見しました。ここではこのタイプの分析のための例として。この画面は、この極性を引き起こしている特定の分子欠陥としてスフィンゴ糖脂質 (GSLs; 義務づける膜脂質、GLS 生合成酵素遺伝子の識別される) の枯渇および小胞のコート クラスリンとその AP 1 アダプターのコンポーネントを識別されます。変換の表現型、それにより分子を人身売買として生体内でこれらの特性の頂端膜の極性とルーメン12,13を位置決め手掛かり。特定の遺伝的変異/形態形質とを開始するときのような画面 (または単一の遺伝的/RNAi 相互作用実験) がも関心 (紙に、排泄に伴う参照の 2 つのまたは複数の遺伝子間の機能的相互作用を調べることができます。このような分析の例の運河)2。このプロトコルは、形態形成の分析の特定の利点で、直接失われる前方の画面での表現型の原因遺伝子を特定する能力に加えて RNAi に焦点を当てください。形態形成をしばしば演出遺伝子製品は、用量依存的に動作したので、RNAi は通常表現型のスペクトルの生成に成功。有益な機能の部分的な損失の表現型を生成する機能はまた重要である tubulogenesis 遺伝子の大半が不可欠であると彼らの損失が不妊や初期胚性致死を引き起こす可能性を問題に対処に役立ちます。このプロトコルは、この困難を克服するために条件付きの RNAi の戦略が含まれています、最適な表現型の突然変異誘発によって生成された対立シリーズなどの広範なスペクトルを生成する方法を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、標準機能喪失遺伝的/RNAi とイメージングを視覚的・分子解剖の生体内でのモデルとして線虫腸上皮の活用 (ラベルと顕微鏡的) アプローチを結合する方法をについて説明します偏光膜と内腔の器官。
ラベリング
このプロトコルは、抗体の汚損に焦点を当てています。その場で抗体による分類蛍光融…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちありがとうマリオ・ デ ・ボノ (MRC 分子生物学研究所、ケンブリッジ、イギリス)、ケネス ・ J Kemphues (コーネル大学、イサカ、米国)、ミシェル ・ Labouesse (Institut de生物学パリ セーヌ川、大学ピエール エ マリー キュリー, パリ, フランス)、グルゴワール ミショー (ユニヴェルシテ・ ド ・レンヌ 1, レンヌ, フランス)、CGC、緊張および抗体の研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金を供給します。この作品は、英領バージン諸島に SAA 223809、MGH は 224570 NIH の GM078653 の助成金によって支えられました。
Materials
| Antibody staining | |||
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Tween | Fisher Scientific | 50-213-612 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Powdered milk | Sigma | MT409-1BTL | |
| Primary antibodies | |||
| MH27 (mouse) | Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| MH33 (mouse) | Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| anti-ICB4 (rabbit) | Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England) | ||
| anti-PAR-3 (rabbit) | Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University) | ||
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Floor 568 (anti-rabbit) | ABCam | AB175471 | Concentration: 1:200 |
| Cy5 (anti-mouse) | Life technologies | A10524 | Concentration: 1:200 |
| TRITC (anti-rabbit) | Invitrogen | T2769 | Concentration: 1:200 |
| FITC (anti-mouse) | Sigma | F9006 | Concentration: 1:100 |
| Labeled chemicals | |||
| Texas Red-Phalloidin | Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471 | ||
| Materials | |||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 4448 | |
| Microscope coverslips (22×22-1) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| C. elegans related | see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures. | ||
| LB Medium and plates | see reference29 for protocols. | ||
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| Ampicillin | Sigma | A0116 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912 | |
| M9 Medium | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| NGM plates | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| RNAi plates | see reference30 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| IPTG | US Biological | I8500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | 50371500 | |
| Bacteria | |||
| OP50 bacteria | CGC | ||
| HT115 bacteria | CGC | ||
| Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) | Source BioScience | ||
| Imaging related | |||
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP9221-500 | |
| Equipment | |||
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-U | |
| dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) | Olympus | SZX12 | |
| Laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystem | TCS SL | |
| laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope | Nikon | C2 |
References
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