ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية
Summary
يعرض هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتقدير إعداد الخلايا العصبية تتميز ستيريولوجيكال غير متحيزة في أسود الدماغ الماوس باستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، مجهر ضوء، يجهز كائن جدول (x, y, z الطائرة)، وبرمجيات المجال العام لتحليل الصور الرقمية.
Abstract
في بحوث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية، تحليل المسالك نيجروسترياتال، بما في ذلك تحديد مقدار الخسارة العصبية تتميز داخل أسود الدماغ، أمرا أساسيا. لتقدير عدد الخلايا العصبية تتميز الإجمالي، يعتبر غير متحيز ستيريولوجي باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية حاليا معيار الذهب. لأن النظرية وراء الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية المعقدة ونظرا لأن ستيريولوجي أمر يصعب تحقيقه دون المعدات المتخصصة، عدة نظم ستيريولوجي كاملة المتاحة تجارياً التي تشمل البرمجيات اللازمة موجودة، محض لعد أسباب الخلية. منذ شراء إعداد ستيريولوجي متخصصة ليست دائماً ممكنة، لأسباب كثيرة، يصف هذا التقرير وسيلة لتقدير ستيريولوجيكال من الخلايا العصبية تتميز بحساب استخدام معدات الفحص المجهري القياسية، بما في ذلك مجهر خفيفة، يجهز كائن الجدول (x، y، z الطائرة) مع برامج التصوير، وجهاز كمبيوتر للتحليل. ويرد شرح خطوة بخطوة حول كيفية إجراء التقدير الكمي ستيريولوجيكال باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية، ويتم توفير ملفات مبرمجة مسبقاً لحساب عدد خلايا المقدرة. وأجرى لتقييم مدى دقة هذا الأسلوب، مقارنة بالبيانات التي تم الحصول عليها من جهاز ستيريولوجي متاحة تجارياً. أرقام الخلية القابلة للمقارنة تم العثور على استخدام هذا البروتوكول والجهاز ستيريولوجي، مما يدل على دقة هذا البروتوكول بالنسبة ستيريولوجي غير متحيزة.
Introduction
التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية يعتبر عنصرا محوريا في أبحاث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية لتحديد مستوى نيوروديجينيريشن داخل المادة الرمادية (SN)1،2. ويعتبر تقدير عدد الخلايا في منطقة لمصلحة ستيريولوجيكال غير متحيزة معيار الذهب3،،من45.
قبل مجيء ستيريولوجي غير منحازة، تم تقييم عدد الخلايا العصبية في الأقسام عن طريق التلاعب في التشكيلات الجانبية للخلية التي تم جردها لتصحيح للاحتمالات متغير أن الخلايا العصبية حيز البصر في مقطع. إحدى الطرق الأكثر استخداماً هو تصحيح عدد خلايا كمياً تصفها ابركرومبي6. هذا الأسلوب وحاول أن تأخذ في الاعتبار أن الخلايا يمكن قياسها كمياً أكثر من مرة إذا تم العثور على أجزاء من نفس الخلية في أقسام رقيقة المتاخمة. وبالتالي، ابركرومبي ومؤلفين آخرين إنشاء المعادلات التي تتطلب افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه ل الخلايا التي تم جردها7،8. بيد هذه الافتراضات عادة لم تتحقق وذلك أدى إلى أخطاء منهجية، والاختلاف من عدد الخلايا الفعلية (أي تحيز). وعلاوة على ذلك، يمكن تخفيض التحيز ليس بأخذ العينات الإضافية3.
لتقدير أرقام الخلية باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ستيريولوجيكال، يتم تطبيق المبادئ الرياضية مباشرة تقدير أرقام الخلية مباشرة في مجلد محدد، ثلاثي الأبعاد. وميزة هذا الأسلوب أنها لا تنطوي على افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه للخلايا يتم حسابها. وهكذا، أرقام الخلية المقدرة هي أقرب إلى القيم الحقيقية والاقتراب كما يزيد حجم العينة (أي، غير متحيز)3. نظراً لأن العديد من القواعد يجب أن يتبع عند استخدام ستيريولوجي للاحتفاظ الطريقة غير متحيزة، وضعت نظم جاهزة للاستخدام التجاري ستيريولوجي (للاستعراض، انظر شميتز وهوف، 20054). نظم ستيريولوجي المتخصصة تنفيذ أساليب ستيريولوجيكال التصميم القائم مع خطط أخذ العينات والمسابير مسبقاً تعريف لتقييمات ستيريولوجيكال التي تؤدي إلى الاستقلال عن الشكل والحجم، والتوزيع المكاني، وتوجه الخلايا يتم تحليلها4،9. ومع ذلك، نظم ستيريولوجي المتاحة تجارياً غالية الثمن؛ وهذا قد يحد من تنفيذ في بحث جديد.
كان الهدف من هذه الدراسة لتطوير تقنية يمكن استخدامها لتقدير ستيريولوجيكال المستندة إلى تصميم عدد خلايا تتميز في الماوس SN، استخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية واستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، خفيفة المجهر مجهر القياسية والبرامج ويجهز x، y، z المرحلة). لهذا، يرد دليل خطوة بخطوة حول كيفية معالجة أنسجة المخ الماوس وكيفية تقدير أرقام الخلية التعطيل باستخدام ستيريولوجي غير منحازة على أساس التصميم. وعلاوة على ذلك، يتم توفير قوالب لحساب أرقام الخلية المقدرة ومعاملات للخطأ (CE).
الأسلوب الموصوفة هنا لا يقتصر على تحليل التعطيل، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام في المناطق الأخرى المحددة تشريحيا الدماغ الماوس أو الفئران. على سبيل المثال، استخدمت ستيريولوجي غير منحازة لتقدير أرقام الخلايا العصبية في قرن آمون10 و كوروليس موضع11. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم أنواع الخلايا عدا الخلايا العصبية، مثل أستروسيتيس12 و microglia13، كذلك. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة للعلماء الذين تعتزم تنفيذ ستيريولوجي غير متحيزة في أبحاثهم ولكنهم ليسوا على استعداد لإنفاق الكثير من المال لشراء نظام ستيريولوجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويبدأ ستيريولوجي مع معالجة الأنسجة. يجب أن يتم قطع الأنسجة SN المسلسل بعناية لمنع الخسائر في الأقسام أثناء تحليل ستيريولوجيكال. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للاحتفال واحد نصف الكرة الأرضية بغية تمييز الحق من اليسار SN عند تنفيذ ستيريولوجي. وضع ثقب صغير في الجزء العلوي من جذع الدماغ تولد نت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ممتنون لروم كيلي ولويزا Frieß، ومنزل هايك لخبراء المساعدة التقنية؛ إلى هيلغا برنر لرعاية الحيوان؛ وإلى جناح س. تشيستوفير لتوليد وتوزيع ديسيكتور البصرية شبكة البرنامج المساعد للبرنامج إيماجيج.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. 신경과학. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
