Stereological vurdering af dopaminerge Neuron antallet i mus Substantia Nigra ved hjælp af optisk fraktioneringskolonne og Standard mikroskopi udstyr
Summary
Dette arbejde præsenterer en trinvis protokol for den uvildige stereological estimering af dopaminerge neuronal celle numre i mus substantia nigra ved hjælp af standard mikroskopi udstyr (dvs. et lysmikroskop en motoriseret objekttabellen (x, y, z fly), og public domain-software til digital billedanalyse.
Abstract
I prækliniske Parkinsons sygdom forskning er analyse af nigrostriatal tarmkanalen, herunder kvantificering af dopaminerge neuron tab inden for substantia nigra, afgørende. For at anslå det samlede dopaminerge neuron nummer, anses upartiske Stereologi ved hjælp af metoden optisk fraktioneringskolonne i øjeblikket guldstandarden. Fordi teorien bag metoden optisk fraktioneringskolonne er komplekse og Stereologi er vanskeligt at opnå uden specialudstyr, eksisterer flere kommercielt tilgængelige komplet Stereologi systemer, der indeholder den nødvendige software, rent for celle tælle grundene. Da køber en specialiseret Stereologi opsætning ikke er altid muligt, af mange grunde, denne rapport beskriver en metode for stereological vurdering af dopaminerge neuronal celle tæller ved hjælp af standard mikroskopi udstyr, herunder et lysmikroskop, en motoriseret objekttabellen (x, y, z flyet) med software til billedbehandling og en computer til analyse. En trin for trin forklaring gives på hvordan man udfører stereological kvantificering ved hjælp af metoden optisk fraktioneringskolonne, og præ-programmerede filer til beregning af forventede celletal leveres. For at vurdere rigtigheden af denne metode, blev en sammenligning med data fra et kommercielt tilgængelige Stereologi apparat udført. Sammenlignelige celle numre blev fundet ved hjælp af denne protokol og Stereologi enhed, dermed demonstrere præcisionen af denne protokol for uvildig Stereologi.
Introduction
Kvantificering af neuronal celle nummer er afgørende i prækliniske Parkinsons sygdom forskning for at fastslå omfanget af neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2. Den uvildige stereological estimering af celle nummer i en region af interesse betragtes som guldstandarden3,4,5.
Før fremkomsten af uvildige Stereologi, blev antallet af neuroner i sektioner vurderet ved at manipulere optalte celle profiler at korrigere for de variable sandsynligheder at neuroner kommer til syne i en sektion. En af de mest almindeligt anvendte metoder var korrektion af kvantificerede celletal beskrevet af Abercrombie6. Denne metode har forsøgt at tage i betragtning at celler kan kvantificeres mere end én gang, hvis fragmenter af den samme celle findes i tilstødende tynde sektioner. Derfor, Abercrombie og andre forfattere genereres ligninger, der kræves antagelser om form, størrelse og retning af optalte celler7,8. Disse antagelser var dog normalt ikke indså og derfor førte til systematisk fejl og afvigelse fra det faktiske celle nummer (dvs. bias). Desuden kunne bias ikke reduceres ved yderligere prøveudtagning3.
Til stereological vurdering af celle numre ved hjælp af den optiske fraktioneringskolonne der matematiske principper anvendes direkte anslå celle tal direkte i en defineret, 3-dimensionelle volumen. Fordelen ved denne metode er, at det ikke indebærer antagelser om form, størrelse og retning af celler der tælles. Således, den anslåede celle numre er tættere på de sande værdier og komme tættere stikprøvestørrelsen stiger (dvs, neutral)3. Fordi mange regler skal følges, når du bruger Stereologi for at holde metoden uvildig, klar-til-brug kommercielle Stereologi systemer har udviklet (til gennemsyn, se Schmitz og Hof, 20054). Specialiserede Stereologi systemer gennemføre design-baseret stereological metoder med en på forhånd defineret sonder og prøvetagningsordninger stereological vurderinger, der fører til uafhængighed fra form, størrelse, geografiske fordeling og orientering af de celler skal være analyseret4,9. Dog er kommercielt tilgængelige Stereologi systemer dyre; Dette kan begrænse gennemførelsen i ny forskning.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en brugbar teknik til design-baseret stereological vurdering af dopaminerge celletal i mus SN, beskæftiger metoden optisk fraktioneringskolonne og ved hjælp af standard mikroskopi udstyr (dvs., lys mikroskop, standard mikroskop software og en motoriseret x, y, z fase). Dette præsenteres en trinvis vejledning om hvordan man behandler mus hjernevæv og skøn SN celle numre ved hjælp af design-baseret upartiske Stereologi. Derudover leveres skabeloner for beregningen af den anslåede celle numre og koefficienter af fejl (CE).
Metoden beskrevet her, er ikke begrænset til analysen af SN, men kan tilpasses til brug i andre anatomisk definerede regioner af hjernen, mus eller rotte. Eksempelvis er upartiske Stereologi blevet brugt til at estimere neuronal celle numre i hippocampus10 og locus coeruleus11. Derudover kan celletyper end neuroner, såsom astrocytter12 og mikroglia13, vurderes som godt. Derfor, denne metode kan være nyttig til forskere, der har til hensigt at iværksætte upartiske Stereologi i deres forskning, men er ikke villig til at bruge en masse penge til at købe en Stereologi system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereologi starter med væv behandling. Den serielle skæring af SN væv skal udføres omhyggeligt for at forhindre tab af dele under stereological analyse. Derudover er et afgørende skridt til at markere en halvkugle for at skelne højre fra venstre SN, når du udfører Stereologi. Placere et lille hul på den øverste del af hjernestammen genereret de bedste resultater i de præsenterede undersøgelse. Desuden siden arbejdet med de optiske fraktioneringskolonne metode kræver, at væv er skåret i tykke sektioner af c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er Keali Röhm, Louisa Frieß og Heike Menzel taknemmelig for deres ekspert teknisk bistand; til Helga Brünner dyrs pleje; og at Chistopher S. Ward til produktion og distribution af optisk disector gitter plugin for ImageJ software.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. 신경과학. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
