Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard
Summary
Cet ouvrage présente un protocole étape par étape pour l’estimation non biaisée stéréologique des numéros des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra de souris à l’aide d’équipement de microscopie standard (c’est-à-dire, un microscope optique, une table objet motorisé (x, y, z avion) et le logiciel du domaine public pour l’analyse d’image numérique.
Abstract
Dans la recherche de la maladie de Parkinson précliniques, analyse des voies sont, y compris la quantification de la perte de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra, est essentielle. Pour estimer le nombre de neurones dopaminergiques total, stéréologie impartiale à l’aide de la méthode de fractionnement optique est actuellement considéré comme l’étalon-or. Parce que la théorie sous-jacente à la méthode de fractionnement optique est complexe et stéréologie étant difficile à atteindre sans équipement spécialisé, plusieurs systèmes de stéréologie complet disponible dans le commerce qui incluent les logiciels nécessaires existent, purement pour cellule de comptage des raisons. Puisque l’achat d’une configuration de stéréologie spécialisé n’est pas toujours réalisable, pour de nombreuses raisons, le présent rapport décrit une méthode pour l’estimation stéréologique des cellules neuronales dopaminergiques compte à l’aide de matériel de microscopie standard, y compris un microscope optique, une motorisé table objet (x, y, plan z) avec logiciel d’imagerie et d’un ordinateur pour analyse. Une explication détaillée est donnée sur la façon d’exécuter stéréologique quantification à l’aide de la méthode de fractionnement optique et fichiers préprogrammés pour le calcul des numérations estimées sont fournis. Pour évaluer la précision de cette méthode, une comparaison avec les données obtenues à partir d’un appareil de stéréologie disponibles dans le commerce a été réalisée. Nombre de cellules comparables ont été trouvé à l’aide de ce protocole et le dispositif de stéréologie, démontrant ainsi la précision du présent protocole pour stéréologie impartiale.
Introduction
La quantification du nombre de cellules neuronales est essentielle dans la recherche de la maladie de Parkinson précliniques pour déterminer le niveau de la neurodégénérescence dans la substantia nigra (SN)1,2. L’estimation non biaisée stéréologique du nombre de cellules dans une région d’intérêt est considéré comme l’étalon-or3,4,5.
Avant l’avènement de stéréologie impartiale, le nombre de neurones dans les sections a été évalué en manipulant les profils de cellules comptées pour corriger les probabilités variables que les neurones entrent en vue dans une section. Une des méthodes plus couramment utilisés est la correction des globules quantifiés décrite par Abercrombie6. Cette méthode a tenté de tenir compte du fait que les cellules peuvent être quantifiées plus d’une fois si les fragments de la même cellule sont trouvent dans les sections minces adjacentes. Par conséquent, Abercrombie et autres auteurs généré équations nécessitant des hypothèses concernant la forme, la taille et l’orientation des cellules compté7,8. Cependant, ces hypothèses n’étaient généralement pas réalisés et donc conduits à des erreurs systématiques et de divergence du nombre de cellule réelle (p. ex., biais). En outre, le biais ne pourrait pas être réduit par échantillonnage supplémentaire3.
Pour l’estimation stéréologique du nombre de cellules à l’aide de l’optique fractionnateur, principes mathématiques sont appliquées pour estimer directement le nombre de cellules directement dans un volume défini, les 3 dimensions. L’avantage de cette méthode est qu’elle n’implique pas d’hypothèses sur la forme, la taille et l’orientation des cellules étant comptés. Ainsi, le nombre de cellules environ est plus proche des valeurs réelles et se rapprocher plus la taille de l’échantillon augmente (c’est-à-dire, non biaisée)3. Parce que de nombreuses règles doivent être suivies lors de l’utilisation de stéréologie de garder la méthode impartiale, prêt à l’emploi commercial stéréologie systèmes ont été développés (pour examen, voir Schmitz et Hof, 2005,4). Stéréologie spécialisés systèmes implémentent les méthodes stéréologiques axée sur la conception à priori définie de sondes et de plans d’échantillonnage pour stéréologiques quotes-parts qui conduisent à l’indépendance de la forme, taille, distribution spatiale et l’orientation de la cellules analysées4,,9. Toutefois, les systèmes de stéréologie disponibles dans le commerce sont chers ; Cela peut limiter la mise en œuvre de nouvelles recherches.
Le but de cette étude était de développer une technique utilisable pour l’estimation stéréologique axée sur la conception du nombre de cellules dopaminergiques chez la souris SN, employant la méthode de fractionnement optique et à l’aide d’équipement de microscopie standard (i.e., lumière microscope, microscope ordinaire logiciels et un motorisé x, y, stade de z). Pour ce faire, un guide étape par étape sur comment traiter les tissus cérébraux de souris et comment estimer le nombre de cellules de SN à l’aide de stéréologie impartiale axée sur la conception est présenté. En outre, des modèles pour le calcul de l’estimation du nombre de cellules et les coefficients d’erreur (EC) sont fournis.
La méthode décrite ici n’est pas limitée à l’analyse de la SN, mais peut être adaptée pour une utilisation dans d’autres régions anatomiquement définies du cerveau de souris ou rat. Par exemple, stéréologie impartiale a été utilisé pour estimer le nombre de neurones dans l’ hippocampe10 et le locus coeruleus11. En outre, les types de cellules autres que les neurones, tels que les astrocytes12 et la microglie13, peuvent être évaluées ainsi. Par conséquent, cette méthode peut être utile aux scientifiques qui prévoient mettre en œuvre la stéréologie impartiaux dans leurs recherches, mais ne sont pas prêts à dépenser beaucoup d’argent pour acheter un système de stéréologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stéréologie commence avec le traitement de tissus. La série Coupe du tissu SN doit être effectuée avec soin afin d’éviter la perte des articles au cours de l’analyse stéréologique. En outre, une étape essentielle consiste à marquer un hémisphère afin de distinguer la droite de la gauche SN lors de l’exécution de stéréologie. Placer un petit trou à la partie supérieure du tronc cérébral généré les meilleurs résultats dans l’étude présentée. En outre, depuis le travail avec les exigences d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants envers Keali Röhm, Louisa Frieß et Heike Menzel pour leur assistance technique expert ; pour Helga Brünner pour la protection des animaux ; et à Chistopher S. Ward pour la production et la distribution du plugin grille optique disector pour les logiciels ImageJ.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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