Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung
Summary
Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.
Abstract
In präklinischen Krankheit Parkinson Forschung unbedingt Analyse des Nigrostriatal Trakt, einschließlich Quantifizierung der dopaminergen Neuronenverlust in der Substantia Nigra. Um die gesamte dopaminergen Neuron Anzahl abschätzen zu können, gilt unvoreingenommene Stereologie mit der optischen Plasmafraktionierer-Methode heute der Goldstandard. Da die Theorie hinter der optischen Plasmafraktionierer Methode Komplex ist und Stereologie schwierig ist, ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen, sind mehrere handelsübliche komplette Stereologie-Systeme, die die notwendige Software enthalten, rein vorhanden für Zelle zählen Gründe. Da Kauf eine spezialisierte Stereologie Setup nicht immer möglich, aus vielen Gründen ist, dieser Bericht beschreibt eine Methode für die stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronale Zelle mit standard-Mikroskopie zählt, einschließlich einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, Z-Ebene) mit imaging-Software und einem Computer für Analyse. Eine schrittweise Erklärung wird zum stereologischen Quantifizierung der optischen Plasmafraktionierer Methode durchführen, und vorprogrammierte Dateien für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen werden zur Verfügung gestellt. Um die Genauigkeit dieser Methode zu bewerten, wurde ein Vergleich mit Daten aus einem handelsüblichen Stereologie Apparat durchgeführt. Vergleichbare Zellzahlen wurden durch dieses Protokoll und dem Stereologie Gerät, so zeigen die Präzision dieses Protokolls für unvoreingenommene Stereologie gefunden.
Introduction
Die Quantifizierung der neuronalen Zellennummer ist von zentraler Bedeutung in der präklinischen Krankheit Parkinson Forschung zur Bestimmung der Höhe der Neurodegeneration in der Substantia Nigra (SN)1,2. Die unparteiische stereologischen Schätzung der Zellzahl in einer Region von Interesse gilt als der Goldstandard3,4,5.
Vor dem Aufkommen der unvoreingenommene Stereologie wurde die Anzahl der Neuronen in den Abschnitten bewertet, durch Manipulation der gezählten Zelle Profile für die Variable Wahrscheinlichkeiten zu korrigieren, dass Neuronen in Sicht in einem Abschnitt kommen. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden wurde die Korrektur des quantifizierten Zellenzahlen von Abercrombie6beschrieben. Diese Methode versucht, zu berücksichtigen, dass die Zellen mehr als einmal quantifiziert werden können, wenn in benachbarten Dünnschliffe Fragmente der gleichen Zelle gefunden werden. Aus diesem Grund generiert Abercrombie und anderen Autoren Gleichungen, die Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der gezählten Zellen7,8erforderlich. Diese Annahmen wurden jedoch in der Regel nicht realisiert und daher führte zu systematischen Fehlern und Abweichungen von der tatsächlichen Zellzahl (d. h. Bias). Darüber hinaus konnte die Vorspannung nicht durch zusätzliche Probenahme3reduziert werden.
Für die stereologischen Schätzung der Zelle Zahlen mit Hilfe der optischen Plasmafraktionierer sind mathematische Prinzipien angewandt, um direkt die Zellzahlen direkt in einem definierten, 3-dimensionale Volumen schätzen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nicht Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der Zellen gezählt werden. So geschätzte Zellzahlen sind näher an die wahren Werte und näher als die Größe der Stichprobe (d.h., unvoreingenommene)3erhöht. Weil viele Regeln befolgt werden müssen, wenn Sie Stereologie verwenden, um die Methode neutral zu halten, Ready-to-Use kommerzielle Stereologie Systeme wurden entwickelt (Übersicht finden Sie unter Schmitz und Hof, 2005-4). Spezialisierte Stereologie Systeme implementieren Sie Design-basierte stereologischen Methoden mit a priori definiert Sonden und Stichprobenpläne für stereologischen Bewertungen, die zur Unabhängigkeit von Form, Größe, räumliche Verteilung und Ausrichtung der führen die Zellen zu analysierten4,9. Handelsübliche Stereologie Systeme sind jedoch teuer; Dies kann die Umsetzung in neue Forschung einschränken.
Das Ziel dieser Studie war es, eine brauchbare Technik für die Design-basierte stereologischen Schätzung der dopaminergen Zellzahlen in der Maus SN, beschäftigt die optische Plasmafraktionierer-Methode und mit standard-Mikroskopie Ausrüstung (z. B. Licht entwickeln Mikroskop, Mikroskop standard Software und einer motorisierten X, y, Z-Phase). Hierfür ist eine Anleitung, wie Sie Maus Hirngewebe zu verarbeiten und SN Zellzahlen mit Design-basierte unvoreingenommene Stereologie abzuschätzen vorgestellt. Darüber hinaus sind Vorlagen für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen und Koeffizienten der Fehler (CE) zur Verfügung gestellt.
Die hier beschriebene Methode beschränkt sich nicht auf die Analyse der SN, aber für den Einsatz in anderen anatomisch definierten Regionen des Gehirns Maus oder Ratte angepasst werden kann. Zum Beispiel, wurde unvoreingenommene Stereologie zur neuronalen Zellzahlen in der Hippocampus-10 und den Locus Coeruleus11zu schätzen. Darüber hinaus können auch Zelltypen als Neuronen, wie Astrozyten12 und Mikroglia13, beurteilt werden. Diese Methode kann daher nützlich für Wissenschaftler, die unvoreingenommene Stereologie in ihrer Forschung durchführen wollen, aber nicht bereit sind, eine Menge Geld um ein Stereologie System zu kaufen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereologie beginnt mit Gewebe Verarbeitung. Das serielle Schneiden von SN Gewebe muss sorgfältig durchgeführt werden, zur Verhinderung des Verlusts der Abschnitte während der stereologischen Analyse. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Schritt, eine Hemisphäre zu kennzeichnen, um das Recht von links SN zu unterscheiden, bei der Durchführung der Stereologie. Platzieren ein kleines Loch am oberen Teil der Hirnstamm erzeugt die besten Ergebnisse in der vorgestellten Studie. Darüber hinaus schneiden da die Arbeit mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar für Keali Röhm, Louisa Frieß und Heike Menzel für ihre kompetente technische Unterstützung; zu Helga Brünner für die Pflege der Tiere; und Chistopher S. Ward für die Erzeugung und Verteilung von optischen Disector Grid Plugin für die ImageJ-Software.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. 신경과학. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
