הערכה stereological של דופאמין נוירון במספר העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד אופטי Fractionator
Summary
עבודה זו מציג עבור הערכת stereological לא משוחדת של מספרים דופאמינרגיים וכולינרגיים פרוטוקול צעד אחר צעד העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד (קרי, מיקרוסקופ אור, טבלה אובייקט ממונע (x, y, z המטוס), ותוכנה הציבור לניתוח תמונה דיגיטלית.
Abstract
במחקר פרקינסון ניסויים פרה-קליניים, ניתוח של דרכי nigrostriatal, לרבות כימות של דופאמין אובדן נוירון בתוך הסובסטנציה ניגרה, חיוני. להעריך את מספר נוירון וכולינרגיים הכולל, לא משוחד stereology בשיטת fractionator אופטי הוא נחשב כיום תקן הזהב. בגלל התיאוריה מאחורי השיטה fractionator אופטי מורכבת, וגם בגלל stereology קשה להשגת ללא ציוד מיוחד, מספר מערכות זמינים מסחרית stereology מלאה הכוללים את התוכנה הדרושה קיימות גרידא תא לספור את הסיבות. מאז רכישת מלכודת stereology המקצועית אינה תמיד אפשרית, מסיבות רבות, דו ח זה מתאר שיטה עבור הערכת stereological של תאים עצביים דופאמין שנחשב שימוש בציוד מיקרוסקופ רגיל, כולל מיקרוסקופ אור, מוטורי בטבלת האובייקטים (x, y, z המטוס) עם תוכנת הדמיה, מחשב לצורך ניתוח. הסבר צעד אחר צעד כיצד לבצע כמת stereological בשיטת fractionator אופטי, ונשאר ניתנים הקבצים מחיישנים לחישוב משוער תא ספירת. כדי להעריך את הדיוק של שיטה זו, בוצעה השוואה לנתונים המתקבלים מנגנון stereology זמינים מסחרית. מספרי הטלפון הנייד דומות נמצאו באמצעות פרוטוקול זה המכשיר stereology, ובכך הממחיש את מידת הדיוק של פרוטוקול זה עבור stereology לא משוחדת.
Introduction
כימות של מספר דופאמינרגיים הוא מרכזי במחקר פרקינסון קליניים כדי לקבוע את מידת הקשורים ניוון מוחיים בתוך הסובסטנציה ניגרה (SN)1,2. הערכת stereological מוטים ממספר תאים באזור של הריבית נחשבת4,3,5תקן הזהב.
לפני כניסתו של stereology מוטים, המספר של נוירונים בחלקים הוערך על-ידי מניפולציה תא שנספרו פרופילים לתיקון ההסתברויות משתנה כי נוירונים נכנס מראה במקטע. אחת השיטות הנפוצות ביותר היה התיקון של כימות ספירת מתוארת על ידי אברקרומבי6. שיטה זו ניסה לקחת בחשבון כי התאים ניתן לכמת יותר מפעם אחת אם נמצאו שברי באותו התא בסעיפים דק סמוכים. לכן, אברקרומבי, מחברים אחרים שנוצרו משוואות נדרש הנחות לגבי הצורה, הגודל והכיוון של תאים ספרתי7,8. עם זאת, בהנחות אלו היו בדרך כלל לא הבין והוביל לכן שגיאות שיטתית של התפצלות ממספר התא בפועל (קרי, הטיה). יתר על כן, הטיה לא יופחת ע י דגימה נוספות3.
עבור הערכת stereological של מספרי הטלפון הנייד באמצעות את fractionator אופטי, עקרונות מתמטיים חלות ישירות מעריכים את מספרי הטלפון הנייד ישירות באמצעי אחסון מוגדרים, תלת-ממדי. היתרון של שיטה זו הוא כי זה אינו כרוך הנחות לגבי הצורה, הגודל והכיוון של התאים התפקדות. לפיכך, מספרי הטלפון הנייד המשוער קרובים יותר ערכי אמת, להתקרב ככל גודל המדגם (קרי, לא משוחד)3. כי רבים לציית לכללים בעת שימוש stereology כדי לשמור את השיטה לא משוחד, פותחו מערכות מוכנות לשימוש מסחרי stereology (לסקירה, ראה שמיץ והוף, 20054). Stereology מתמחה במערכות ליישם מבוססי עיצוב stereological שיטות עם אפריורי שהוגדרו הגששים וערכות דגימה עבור הערכות stereological להוביל העצמאות צורה, גודל, התפוצה המרחבית, כיוון תאים להיות שנותחה4,9. עם זאת, מערכות stereology זמינים מסחרית יקרים; זה עלול להגביל יישום במחקר חדש.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח טכניקה שמיש עבור הערכת stereological מבוסס על עיצוב של דופאמין תא ספירת העכבר SN, כשנוקטים בשיטה fractionator אופטי והשימוש בציוד מיקרוסקופ רגיל (קרי, אור מיקרוסקופ תוכנה מיקרוסקופ רגיל, ממונע x, y, z הבמה). בשביל זה, מוצג מדריך צעד אחר צעד על כיצד לעבד רקמת מוח העכבר וכיצד להעריך את מספרי הטלפון הנייד SN באמצעות מבוססי עיצוב stereology לא משוחדת. יתר על כן, תבניות עבור חישוב המספרים תא המשוער ואת המקדמים של שגיאה (CE) הינם מסופקים.
השיטה המתוארת כאן אינה מוגבלת לניתוח של SN, אך ניתן להתאים לשימוש באזורים שהוגדרו מבחינה אנטומית אחרים של המוח עכבר או חולדה. למשל, stereology מוטים שימש כדי להעריך את מספרי הטלפון הנייד עצביים בהיפוקמפוס10 , לוקוס coeruleus11. בנוסף, סוגי תאים שאינם הנוירונים, כגון האסטרוציטים12 ו מיקרוגלייה13, יכול להיות מוערך גם כן. לכן שיטה זו יכולה להיות שימושית למדענים מי מתכוון ליישם stereology מוטים במחקר שלהם אבל הם לא מוכנים להשקיע הרבה כסף כדי לרכוש מערכת stereology.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology מתחיל עם עיבוד רקמות. חיתוך סדרתי של SN רקמה יש לבצע בזהירות כדי למנוע האובדן של מקטעים במהלך ניתוח stereological. בנוסף, הוא צעד חיוני כדי לסמן והזיז חצי אחד על מנת לבדל את הזכות מן השמאל SN בעת ביצוע stereology. הצבת לחור קטן בחלק העליון של גזע המוח להפיק את התוצאות הטובות ביותר במחקר הציג. יתר על כ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Keali רוהם, לואיזה Frieß של הייקה מנזל לסיוע טכני מומחה שלהם; כדי הלגה Brünner על הטיפול בבעלי חיים; וכדי Chistopher וורד ס הדור והפצה של התוסף רשת disector אופטי עבור התוכנה ImageJ.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. 신경과학. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
