माउस Substantia नाइग्रा में Dopaminergic ंयूरॉन संख्या का Stereological आकलन ऑप्टिकल Fractionator और मानक माइक्रोस्कोपी उपकरण का उपयोग
Summary
यह काम माउस substantia नाइग्रा मानक माइक्रोस्कोपी उपकरण (यानी, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप, एक मोटर चालित वस्तु तालिका (एक्स, वाई, जेड का उपयोग कर में dopaminergic ंयूरॉन कोशिका संख्या के निष्पक्ष stereological आकलन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है विमान), और डिजिटल छवि विश्लेषण के लिए सार्वजनिक डोमेन सॉफ्टवेयर ।
Abstract
पूर्व में नैदानिक पार्किंसंस रोग अनुसंधान, nigrostriatal पथ का विश्लेषण, substantia नाइग्रा के भीतर dopaminergic ंयूरॉन नुकसान के ठहराव सहित, आवश्यक है । कुल dopaminergic ंयूरॉन संख्या का अनुमान लगाने के लिए, ऑप्टिकल fractionator विधि का उपयोग कर निष्पक्ष stereology वर्तमान में सोने के मानक माना जाता है । क्योंकि ऑप्टिकल fractionator विधि के पीछे सिद्धांत जटिल है और क्योंकि stereology विशेष उपकरणों के बिना प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरा stereology सिस्टम है कि आवश्यक सॉफ्टवेयर शामिल हैं, शुद्ध रूप से मौजूद है सेल गिनती कारणों के लिए । क्रय के बाद से एक विशेष stereology सेटअप हमेशा संभव नहीं है, कई कारणों के लिए, इस रिपोर्ट के stereological आकलन के लिए एक विधि का वर्णन करता है dopaminergic न्यूरॉन सेल मानक माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग कर गिना जाता है, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप सहित, एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ मोटर चालित वस्तु तालिका (एक्स, वाई, जेड विमान), और विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर. एक चरण दर चरण विवरण ऑप्टिकल fractionator विधि का उपयोग कर stereological ठहराव निष्पादित करने के लिए पर दिया जाता है, और अनुमानित कक्ष गणना की गणना के लिए पूर्व-क्रमादेशित फ़ाइलें प्रदान किए जाते हैं । इस विधि की सटीकता का आकलन करने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology उपकरण से प्राप्त डेटा की तुलना की गई थी । तुलनीय सेल संख्या इस प्रोटोकॉल और stereology डिवाइस का उपयोग कर पाया गया, इस प्रकार निष्पक्ष stereology के लिए इस प्रोटोकॉल की परिशुद्धता का प्रदर्शन ।
Introduction
substantia नाइग्रा (SN)1,2के भीतर neurodegeneration के स्तर का निर्धारण करने के लिए पूर्व नैदानिक पार्किंसंस रोग अनुसंधान में न्यूरॉन कोशिका संख्या के ठहराव को निर्णायक है. ब्याज के एक क्षेत्र में सेल संख्या के निष्पक्ष stereological आकलन सोने के मानक3,4,5माना जाता है ।
निष्पक्ष stereology के आगमन से पहले, वर्गों में न्यूरॉन्स की संख्या चर संभावनाओं के लिए सही करने के लिए सेल प्रोफाइल गिना हेरफेर द्वारा मूल्यांकन किया गया था कि न्यूरॉन्स एक अनुभाग में नजर में आते हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक मात्रा सेल गिनती के सुधार Abercrombie6द्वारा वर्णित किया गया था । इस विधि को ध्यान में रखने का प्रयास किया है कि कोशिकाओं को एक से अधिक मात्रा जा सकता है अगर एक ही कोशिका के टुकड़े आसंन पतले वर्गों में पाए जाते हैं । इसलिए, Abercrombie और अंय लेखकों समीकरण है कि आकार, आकार, और गिने कोशिकाओं7,8के उंमुखीकरण के बारे में मांयताओं की आवश्यकता उत्पंन । हालांकि, इन मांयताओं आमतौर पर महसूस नहीं किया गया और इसलिए व्यवस्थित त्रुटियों और वास्तविक कोशिका संख्या से विचलन के नेतृत्व में (यानी, पूर्वाग्रह) । इसके अलावा, पूर्वाग्रह अतिरिक्त नमूना3से कम नहीं किया जा सकता है ।
कक्ष संख्या ऑप्टिकल fractionator का उपयोग कर के stereological आकलन के लिए, गणितीय सिद्धांतों को सीधे एक परिभाषित, 3 आयामी मात्रा में सीधे सेल संख्या का अनुमान लागू कर रहे हैं । इस विधि का लाभ यह है कि यह आकार, आकार के बारे में अनुमान शामिल नहीं करता है, और कोशिकाओं के उंमुखीकरण गिना जा रहा है । इस प्रकार, अनुमानित सेल संख्या सही मूल्यों के करीब हैं और नमूना आकार बढ़ जाती है के रूप में करीब हो (यानी, निष्पक्ष)3. चूंकि विधि को निष्पक्ष बनाए रखने के लिए stereology का उपयोग करते समय कई नियमों का पालन करना आवश्यक है, इसलिए तैयार करने के लिए उपयोग किया गया वाणिज्यिक stereology सिस्टम विकसित किया गया है (समीक्षा के लिए, Schmitz और Hof, २००५4देखें) । विशेषीकृत stereology प्रणालियों को लागू करने के साथ डिजाइन आधारित stereological तरीके एक प्राथमिकताओं परिभाषित जांच और stereological आकलन है कि आकार, आकार, स्थानिक वितरण से स्वतंत्रता के लिए नेतृत्व के लिए नमूना योजनाओं, और के उंमुखीकरण कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए4,9. हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology सिस्टम महंगे हैं; इस नए शोध में कार्यांवयन की सीमा हो सकती है ।
इस अध्ययन का उद्देश्य माउस एसएन में dopaminergic कोशिका गिनती के डिजाइन आधारित stereological आकलन के लिए एक प्रयोग करने योग्य तकनीक विकसित करना था, ऑप्टिकल fractionator विधि को रोजगार और मानक माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग (यानी, प्रकाश माइक्रोस्कोप, मानक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर, और एक मोटर चालित एक्स, वाई, जेड चरण). इस के लिए, कैसे माउस मस्तिष्क ऊतक की प्रक्रिया पर एक कदम दर कदम गाइड और कैसे का अनुमान SN सेल नंबर डिजाइन आधारित निष्पक्ष stereology का उपयोग कर प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, अनुमानित कक्ष संख्याओं और त्रुटि (CE) के गुणांक की गणना के लिए टेम्पलेट्स प्रदान किए जाते हैं.
यहां वर्णित विधि SN के विश्लेषण तक ही सीमित नहीं है, लेकिन माउस या चूहे मस्तिष्क के अंय शारीरिक परिभाषित क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, निष्पक्ष stereology हिप्पोकैंपस10 और लोकस coeruleus11में न्यूरॉन सेल संख्या अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. साथ ही, astrocytes12 और microglia13जैसे न्यूरॉन्स के अलावा कक्ष प्रकार, के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन किया जा सकता है । इसलिए, यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी हो सकती है जो अपने शोध में निष्पक्ष stereology को लागू करने का इरादा रखते हैं लेकिन एक stereology प्रणाली की खरीद के लिए बहुत सारा पैसा खर्च करने को तैयार नहीं हैं ।
Protocol
पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए सभी लागू अंतर्राष्ट्रीय, राष्ट्रीय और/या संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन किया गया । प्रोटोकॉल Regierung वॉन Unterfranken, Wuerzburg, जर्मनी में स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गय…
Representative Results
Discussion
Stereology ऊतक प्रसंस्करण के साथ शुरू होता है । stereological विश्लेषण के दौरान अनुभागों की हानि को रोकने के लिए SN ऊतक का सीरियल कटिंग सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए । साथ ही, stereology प्रदर्शन करते समय बाएं SN से दाईं ओर भेद ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपने विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Keali Röhm, Louisa Frieß, और हाइके Menzel के प्रति कृतज्ञ हैं; पशु देखभाल के लिए हेल्गा Brünner करना; और जनरेशन और ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए ऑप्टिकल disector ग्रिड प्लगइन के वितरण के लिए Chistopher एस वार्ड के लिए ।
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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