광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정
Summary
이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.
Abstract
전 임상 파 킨 슨 병 연구에 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 손실의 정량화를 포함 하 여 nigrostriatal로 분석은 필수적입니다. 총 dopaminergic 신경 세포 숫자를 예상 하려면 편견된 stereology 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 현재 이라고 여겨진다 금 표준. 광학 fractionator 메서드 뒤에 이론은 복잡 하 고 stereology 전문된 장비 없이 달성 하기 어렵습니다, 때문에 필요한 소프트웨어를 포함 하는 여러 상용 완료 stereology 시스템 존재, 순전히 있기 때문에 셀에 대 한 이유를 계산. 이 보고서에 dopaminergic 신경 세포의 stereological 추정 가벼운 현미경을 포함 하 여 표준 현미경 장비를 사용 하 여 계산에 대 한 방법을 설명 합니다 이후 특수 stereology 설치 구입은 항상 가능 하 고, 여러 가지 이유로, 한 이미징 소프트웨어와 분석에 대 한 컴퓨터 개체 테이블 (x, y, z 평면)를 자동화. 단계별 설명은 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 stereological 정량화를 수행 하는 방법에 부여 되 고 예상된 셀 개수 계산에 대 한 사전 프로그램 된 파일 제공 됩니다. 이 방법의 정확도 평가, 하 상용 stereology 장치에서 가져온 데이터에 대 한 비교는 수행 되었다. 유사한 핸드폰 번호가 프로토콜과 stereology 장치를 사용 하 여 따라서 편견된 stereology이이 프로토콜의 정밀도 보여주는 발견 됐다.
Introduction
신경 세포 수의 부 량은 neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2에서 레벨을 전 임상 파 킨 슨 병 연구에. 관심의 영역에 셀 수의 편견된 stereological 추정 금3,,45으로 간주 됩니다.
편견된 stereology의 도래 하기 전에 섹션에서 신경 세포의 수는 뉴런 섹션에 광경에와 서 가변 확률에 대 한 수정 계산된 셀 프로 파일을 조작 하 여 평가 했다. 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 아베 크롬 비6에 의해 설명 된 정량된 셀의 정정 했다. 이 방법은 세포 조각 같은 셀의 인접 한 얇은 섹션에서 발견 되는 경우 여러 번 측정할 수는 계정에 걸릴 하려고 했습니다. 따라서, 아베 크롬 비와 다른 저자 모양, 크기, 및 계산된 셀7,8의 방향에 대 한 정의 요구 하는 방정식을 생성. 그러나, 이러한 가정 일반적으로 하지 실현 되었고 따라서 실제 휴대폰 번호 (즉, 바이어스)에서 체계적인 오류 및 분기에 led. 또한, 바이어스 추가 샘플링3으로 줄일 수 없습니다.
Stereological 광학 fractionator를 사용 하 여 셀 수 추정에 대 한 수학적 원리 직접 정의 3 차원 볼륨에 직접 셀 숫자를 추정에 적용 됩니다. 이 방법의 장점은 그것은 모양, 크기, 및 계산 셀의 방향에 대 한 가정을 포함 하지 않습니다. 따라서, 예상된 핸드폰 번호는 참 값에 가까운 고 가까이 샘플 크기가 증가 (즉, 편견)3. Stereology 편견 메서드를 계속 사용 하는 경우 많은 규칙을 따라야 합니다, 때문에 준비-사용 상업 stereology 시스템 개발 되었습니다 (검토를 위해 참조 슈 미 츠, 호프, 20054). 전문된 stereology 시스템 디자인-기반 stereological 메서드 구현 선험적 정의 프로브와 샘플링 방식을 모양, 크기, 공간 배급, 및의 방향에서 독립을 이끌어 내는 stereological 평가 분석 된4,9에 셀. 그러나, 상용 stereology 시스템 비싸다; 이 새로운 연구에서 제한할 수 있습니다.
이 연구의 목표는 SN, 광학 fractionator 메서드를 사용 하 고 표준 현미경 장비 (즉, 빛을 사용 하 여 마우스에서 dopaminergic 셀의 디자인 기반 stereological 추정에 대 한 사용 가능한 기술을 개발 했다 현미경, 표준 현미경 소프트웨어 및는 자동화 한 x, y, z 단계). 이 위해, 마우스 뇌 조직 처리 하는 방법과 편견된 stereology 디자인-기반을 사용 하 여 SN 셀 숫자를 예측 하는 방법에 대 한 단계별 가이드를 제시 합니다. 또한, 예상된 셀 숫자의 계산 및 오류 (CE)의 계수에 대 한 템플릿은 제공 합니다.
여기에 설명 된 메서드는 SN의 분석에 국한 되지 않습니다 하지만 마우스 또는 쥐 뇌의 해부학 적 정의 다른 영역에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 편견된 stereology 마10 과 로커 스 coeruleus11신경 세포 숫자를 추정 사용 되었습니다. 또한, 신경, 이다12 와 microglia13, 등 다른 세포 유형 뿐만 평가 될 수 있다. 따라서,이 방법은 그들의 연구에서 편견된 stereology를 구현 하고자 하지만 많은 stereology 시스템을 구입 하는 돈 지출 하고자 하는 과학자에 게 유용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology는 조직 처리를 시작합니다. SN 조직의 직렬 절단 stereological 분석 하는 동안 섹션의 손실을 방지 하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 또한, 하나의 필수 단계 stereology 수행할 때 SN 왼쪽에서 오른쪽을 구별 하기 위해 한 반구를 표시 하는. Brainstem의 상단 부분에 작은 구멍을 배치 제시 연구에서 최상의 결과 생성. 또한, 조직이 광학 fractionator 방법 요구 작업 이후 약 30-40 µ m 보다는 더 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 전문 기술 지원; Keali 룀, 루이자 Frieß, 하이 케 멘 젤 감사 헬가 Brünner 동물 보호; 대 하 그리고 생성 및 ImageJ 소프트웨어에 대 한 광학 disector 그리드 플러그인의 배포에 대 한 Chistopher S. 병 동.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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