Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia
Summary
Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.
Abstract
Em pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson, análise do tracto nigrostriatal, incluindo a quantificação da perda de neurônio dopaminérgico dentro da substantia nigra, é essencial. Para estimar o número de neurônios dopaminérgicos total, imparcial stereology usando o método fracionador óptico atualmente é considerada o padrão-ouro. Porque a teoria por trás do método fracionador óptico é complexa e stereology é difícil de alcançar sem equipamento especializado, vários sistemas disponíveis comercialmente stereology completa que incluem o software necessário existe, puramente para celular contando razões. Uma vez que compra uma instalação especializada stereology não é sempre viável, por muitas razões, este relatório descreve um método para a estimativa stereological da célula neuronal dopaminergic conta usando equipamentos de microscopia padrão, incluindo um microscópio de luz, um motorizado objeto da tabela (x, y, z plano) com o software de imagem e um computador para análise. Uma explicação passo a passo é dada sobre como realizar a quantificação stereological usando o método fracionador óptico e arquivos previamente programados para o cálculo de contagem de células estimados são fornecidos. Para avaliar a precisão desse método, foi realizada uma comparação com dados obtidos de um aparelho stereology comercialmente disponível. Números de telemóvel comparáveis foram encontrados usando este protocolo e o dispositivo stereology, demonstrando assim a precisão do presente protocolo para stereology imparcial.
Introduction
A quantificação do número de células neuronais é crucial na investigação pré-clínica da doença de Parkinson, para determinar o nível de neurodegeneração dentro da substância negra (SN)1,2. A imparcial stereological estimativa do número de células em uma região de interesse é considerada o padrão-ouro,3,4,5.
Antes do advento do stereology imparcial, o número de neurônios em seções foi avaliado através da manipulação de células contadas perfis para corrigir as probabilidades variáveis que neurônios entram em vista em uma seção. Um dos métodos mais utilizados era a correção da contagem de células quantificados descrito por Abercrombie6. Este método tentou levar em conta que as células possam ser quantificadas mais uma vez se encontram-se fragmentos da mesma célula em seções finas adjacentes. Portanto, Abercrombie e outros autores geraram equações que exigia a suposições sobre a forma, tamanho e orientação de células contadas7,8. No entanto, essas suposições foram geralmente não percebeu e, portanto, levou a erros sistemáticos e divergência do número real da célula (isto é, preconceito). Além disso, o preconceito não poderia ser reduzido por amostragem adicionais3.
Para a stereological estimativa do número de células usando o fracionador óptico, princípios matemáticos são aplicados para estimar diretamente o número de células diretamente em um volume definido, 3-dimensional. A vantagem deste método é que não envolve pressupostos sobre a forma, tamanho e orientação das células sendo contadas. Assim, o número de células estimado aproximam-se para os verdadeiros valores e se aproximar à medida que o tamanho da amostra aumenta (ou seja, imparcial)3. Porque muitas regras devem ser seguidas ao usar stereology para manter o método imparcial, foram desenvolvidos sistemas prontos para uso comercial stereology (para revisão, consulte Schmitz e Hof, 2005,4). Sistemas especializados stereology implementam métodos stereological design baseado com um priori definido sondas e esquemas de amostragem para as avaliações stereological que levam à independência da forma, tamanho, distribuição espacial e a orientação do células a ser analisados4,9. No entanto, sistemas stereology comercialmente disponíveis são caros; Isto pode limitar a implementação em novas pesquisas.
O objetivo deste estudo foi desenvolver uma técnica útil para a estimativa stereological baseada em projeto de contagem de células dopaminérgicas no mouse SN, empregando o método fracionador óptico e usando equipamentos de microscopia padrão (ou seja, luz microscópio, microscópio padrão software e uma motorizada x, y, z estágio). Por isso, é apresentado um guia passo a passo sobre como processar o tecido de cérebro de rato e como estimar o número de células do SN usando stereology imparcial baseado em projeto. Além disso, os modelos para o cálculo dos números de célula estimado e coeficientes de erro (CE) são fornecidos.
O método descrito aqui não é limitado à análise da SN, mas pode ser adaptado para uso em outras regiões anatomicamente definidas do cérebro do rato ou rato. Por exemplo, stereology imparcial tem sido usada para estimar os números de celular neuronal no hipocampo10 e o locus coeruleus11. Além disso, tipos de células que não sejam os neurônios, tais como astrócitos12 e microglia13, podem ser avaliados também. Portanto, esse método pode ser útil para os cientistas que pretendem implementar stereology imparcial em suas pesquisas, mas não estão dispostos a gastar muito dinheiro para comprar um sistema stereology.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology começa com o processamento do tecido. O serial corte de tecido SN deve ser realizado com cuidado para evitar a perda de seções durante a análise stereological. Além disso, é um passo essencial para marcar um hemisfério a fim de distinguir a direita da esquerda SN ao executar stereology. Colocação de um pequeno orifício na parte superior do tronco cerebral gerou os melhores resultados no estudo apresentado. Além disso, desde que está com as exigências do método fracionador óptico que o tecido é …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos Keali Röhm, Louisa Frieß e Heike Menzel para sua assistência técnica especializada; a Helga Brünner para o cuidado de animais; e a Chistopher S. Ward para a geração e a distribuição do disector óptica grade plugin para o software ImageJ.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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