Стереологических Оценка числа дофаминергических нейронов в Substantia мыши, с помощью оптических фракционатор и стандартных микроскопии оборудование
Summary
Эта работа представляет пошаговые протокол для объективной стереологических оценки числа дофаминергических нейронов клеток в Substantia мыши, с помощью микроскопии стандартного оборудования (т.е., световой микроскоп, моторизованные объекта таблицы (x, y, z плоскость) и общественное достояние программного обеспечения для анализа цифровых изображений.
Abstract
В болезнь Паркинсона доклинические исследования анализ Нигростриарный тракта, включая количественную оценку дофаминергической нейрон потери в пределах substantia nigra, имеет важное значение. Для оценки числа общей дофаминергической нейрон, объективной stereology с помощью метода оптического фракционатор в настоящее время считается золотым стандартом. Поскольку теория оптических фракционатор метод является сложным и stereology трудно добиться без специализированного оборудования, несколько коммерчески доступных полный stereology систем, которые включают необходимое программное обеспечение существует, чисто для подсчета причин ячейки. Поскольку приобретение специализированного stereology установки не всегда возможно, по многим причинам, этот доклад описывает метод для стереологических оценки дофаминергической нейрональные клетки подсчитывает с использованием стандартных микроскопии оборудования, в том числе световой микроскоп, моторизованные таблицы объектов (x, y, z плоскости) с изображений программное обеспечение и компьютер для анализа. Дается подробное объяснение на как выполнить стереологических количественной оценки, с помощью метода оптического фракционатор, и предоставляются запрограммированные файлы для расчета сметных клеток. Чтобы оценить точность этого метода, было выполнено сравнение данных, полученных из коммерчески доступных stereology аппарат. Числа сопоставимых клеток были найдены с помощью этого протокола и stereology устройство, продемонстрировав тем самым точность этого протокола для объективной stereology.
Introduction
Количественная оценка количества нейрональных клеток играет важнейшую роль в доклинических болезнь Паркинсона исследования для определения уровня нейродегенеративные в1,nigra substantia (SN)2. Объективной оценки стереологических клеток количество интерес в регионе считается золотым стандартом3,4,5.
До появления объективной stereology количество нейронов в разделах оценивалась путем манипулирования профили подсчет клеток исправить для переменной вероятностей, что нейроны вступают в прицел в секции. Одним из наиболее часто используемых методов была коррекция количественных клеток характеризуется Аберкромби6. Этот метод попытался принять во внимание, что клетки могут быть количественно более одного раза, если фрагменты же клетки находятся в прилегающих шлифов. Поэтому Аберкромби и другие авторы генерируется уравнений, которые требуют предположений о форме, размер и ориентацию в подсчет клеток7,8. Однако эти предположения были обычно не понял и поэтому привело к систематической ошибки и расхождения из числа фактических ячейки (то есть, смещения). Кроме того смещение не может сводиться на дополнительные выборки3.
Для стереологических оценки числа клеток с помощью оптических фракционатор математические принципы применяются непосредственно оценить число клеток непосредственно в определенных, 3-мерного объема. Преимуществом этого метода является, что она не предполагает предположения о форму, размер и ориентацию подсчитываемое клеток. Таким образом число оценкам клеток ближе к подлинным ценностям и ближе, как размер выборки увеличивается (т.е. объективное)3. Потому что многие правила должны соблюдаться при использовании stereology держать метод объективной, готовые к использованию коммерческих stereology системы были разработаны (для обзора, см Schmitz и Hof, 20054). Специализированных stereology систем реализации дизайн-методы на основе стереологических с априори определены зондов и схем отбора проб для стереологических оценок, которые приводят к независимости от формы, размера, пространственное распределение и ориентации клетки, чтобы быть проанализированы4,9. Однако коммерчески доступных stereology системы являются дорогостоящими; Это может ограничить осуществление в новых исследований.
Целью данного исследования было разработать полезная методика на основе дизайна стереологических оценки дофаминергической клеток мыши SN, используя стандартные микроскопии оборудования (то есть, свет и метод оптического фракционатор Микроскоп, стандартные Микроскоп программного обеспечения и моторизованных x, y, z этап). Для этого представлено пошаговое руководство по как обрабатывать ткани мозга мыши и как оценить SN числа клеток с помощью дизайн на основе объективной stereology. Кроме того предоставляются шаблоны для расчета числа оценкам клеток и коэффициентов ошибки (CE).
Метод, описанный здесь не ограничивается анализ SN, но могут быть адаптированы для использования в других анатомически определенных регионах мозга мыши или крысы. К примеру объективной stereology был использован для оценки числа нейрональных клеток в гиппокампе10 и Локус пятно11. Кроме того типы клеток помимо нейронов, например астроциты12 и микроглии13, можно оценить как хорошо. Таким образом этот метод может быть полезным для ученых, которые намерены реализовать объективной stereology в их исследований, но не готовы тратить много денег на покупку stereology системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology начинается с обработки ткани. Серийный резки SN ткани должны быть выполнены тщательно во избежание потери разделов во время стереологических анализа. Кроме того одним важным шагом является Марк одного полушария для того, чтобы отличить право от левый SN при выполнении stereology. Разме?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Keali Röhm, Луиза Frieß и Хайке Menzel за их экспертной технической помощи; в Helga Брюннер для ухода за животными; и Chistopher S. палату для генерации и распространения оптических disector сетка плагинов для ImageJ программного обеспечения.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. 신경과학. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
