Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar
Summary
Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para la estimación imparcial estereológicos del número de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra de ratón utilizando equipo de microscopía estándar (es decir, un microscopio de luz, una tabla de objeto motorizado (x, y, z plano) y software de dominio público para el análisis de imagen digital.
Abstract
En la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica, el análisis del tracto nigroestriatal, incluyendo la cuantificación de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia, es esencial. Para estimar el número de neuronas dopaminérgicas total, estereología imparcial usando el método de fraccionamiento óptico es considerado el estándar de oro. Porque la teoría detrás del método óptico fraccionador es complejo y porque estereología es difícil de lograr sin equipos especializados, existen varios sistemas de estereología completa disponible en el mercado que incluyen el software necesario, puramente para celular con razones. Desde adquirir una configuración de estereología especializados no siempre es factible, por muchas razones, este informe describe un método para la estimación Estereológicas de células neuronales dopaminérgicas cuenta con equipo de microscopia estándar, incluyendo un microscopio de luz, un motorizado de tabla de objeto (x, y, z plano) con software tratamiento de imágenes y una computadora para el análisis. Se da una explicación paso a paso sobre cómo realizar Estereológicas cuantificación mediante el método de fraccionamiento óptico, y se proporcionan archivos preprogramados para el cálculo del estimado del recuento. Para evaluar la exactitud de este método, se realizó una comparación con datos obtenidos de un aparato de estereología comercialmente disponibles. Un número similar de células fueron encontrado usando este protocolo y el dispositivo de la estereología, demostrando así la precisión de este protocolo de estereología imparcial.
Introduction
La cuantificación del número de célula neuronal es fundamental en la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica para determinar el nivel de la neurodegeneración en la substantia nigra (SN)1,2. La estimación imparcial Estereológicas del número de células en una región de interés se considera el estándar de oro3,4,5.
Antes del advenimiento de estereología imparcial, se evaluó el número de neuronas en secciones mediante la manipulación de células contadas perfiles para corregir para las probabilidades variables que las neuronas entran en vista en una sección. Uno de los métodos más utilizados fue la corrección de un recuento cuantificados descritos por Abercrombie6. Este método tratado de tomar en cuenta que las células se pueden cuantificar más de una vez si fragmentos de la misma célula se encuentran en las secciones delgadas adyacentes. Por lo tanto, Abercrombie y otros autores generaron ecuaciones que requieren supuestos sobre la forma, tamaño y orientación de las células contadas7,8. Sin embargo, estos supuestos fueron generalmente no se dio cuenta y por lo tanto condujo a errores sistemáticos y divergencia del número real de la célula (es decir, sesgo). Por otra parte, no podría reducirse el sesgo de muestreo adicional3.
Para la estimación Estereológicas de números de celular mediante el fraccionador óptico, se aplican principios matemáticos para estimar directamente el número de células en un volumen definido, 3 dimensiones. La ventaja de este método es que no involucra supuestos sobre la forma, tamaño y orientación de las células se contaron. Así, el número estimado de la célula está más cercano de los verdaderos valores y acercarse a medida que el tamaño de muestra aumenta (es decir, imparciales)3. Porque muchas reglas deben seguirse cuando se usa la estereología para mantener el método imparcial, se han desarrollado sistemas de estereología comercial lista para usar (para revisión, ver Schmitz y Hof, 2005,4). Sistemas especializados de estereología implementan métodos estereológicos basados en diseño con sondas de priori definidos y planes de muestreo para evaluaciones estereológicos que conducen a la independencia de la forma, tamaño, distribución espacial y orientación de la células para ser analizado4,9. Sin embargo, los sistemas de estereología comercialmente disponibles son caros; Esto puede limitar la aplicación en una nueva investigación.
El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica útil para la estimación Estereológicas basado en el diseño de recuentos de células dopaminérgicas en el ratón SN, empleando el método de fraccionamiento óptica y uso de equipo de microscopia estándar (es decir, luz microscopio, microscopio estándar de software y un motor x, y, z etapa). Para ello, se presenta una guía paso a paso sobre cómo procesar el tejido de cerebro de ratón y cómo estimar el número de células del SN mediante estereología imparcial basada en diseño. Además, se proporcionan plantillas para el cálculo de los números de celular Estimado y los coeficientes de error (CE).
El método descrito aquí no se limita al análisis del SN, pero puede ser adaptado para su uso en otras regiones anatómicamente definidas del cerebro de ratón o rata. Por ejemplo, estereología imparcial se ha utilizado para estimar el número de células neuronales en el hipocampo10 y el locus coeruleus11. Además, tipos de células distintos de neuronas, como12 y microglia astrocitos13, pueden ser evaluados también. Por lo tanto, este método puede ser útil para los científicos que pretenden implementar estereología imparcial en sus investigaciones, pero no están dispuestos a gastar mucho dinero para comprar un sistema de estereología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estereología se inicia con el proceso de tejido. La serie corte de tejido SN debe realizarse cuidadosamente para evitar la pérdida de las secciones durante el análisis estereológicos. Además, un paso esencial es marcar un hemisferio para distinguir la derecha de la izquierda SN realización de estereología. Colocar un pequeño agujero en la parte superior del tronco encefálico genera los mejores resultados en el estudio presentado. Por otra parte, desde el trabajo con las exigencias de método fraccionador óptico…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecemos a Keali Röhm, Louisa Frieß y Heike Menzel por su asistencia técnica especializada; a Helga Brünner para el cuidado de los animales; y Chistopher S. Ward para la generación y distribución del disector óptico grid plugin para el software ImageJ.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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