Beteendetester uppskattning av dopaminerga Neuron antal mus Substantia Nigra med hjälp av optisk naftafraktioneringskolonn och Standard mikroskopi utrustning
Summary
Detta arbete presenterar ett stegvisa protokoll för opartisk beteendetester uppskattning av dopaminerga neuronala cell nummer i mus substantia nigra med standard mikroskopi utrustning (dvs. ett ljusmikroskop, en motoriserad objekttabellen (x, y, z planet), och offentlig domän programvara för digital bildanalys.
Abstract
I prekliniska Parkinsons Sjukdomforskning är analys av nigrostriatala tarmkanalen, inklusive kvantifiering av dopaminerga neuron i substantia nigra, viktigt. För att uppskatta antalet totala dopaminerga neuron, anses opartisk stereology med metoden optisk naftafraktioneringskolonn för närvarande guldmyntfoten. Eftersom teorin bakom metoden optiska naftafraktioneringskolonn är komplex och stereology är svårt att uppnå utan specialutrustning, finns flera kommersiellt tillgängliga komplett stereology system som inkluderar den nödvändiga programvaran, rent för cell räknar skäl. Sedan köpa en specialiserad stereology setup inte är alltid möjligt, av många skäl, denna rapport beskriver en metod för beteendetester uppskattning av dopaminerga neuronala cell räknar med standard mikroskopi utrustning, inklusive ett ljusmikroskop, en motoriserade objekttabellen (x, y, z plan) med programvara för bildåtergivning och en dator för analys. En steg för steg förklaring ges om hur man utför beteendetester kvantifiering med metoden optisk naftafraktioneringskolonn och förprogrammerade filer för beräkning av uppskattade blodkroppar finns. För att bedöma riktigheten av denna metod, utfördes en jämförelse till uppgifter som erhållits från en kommersiellt tillgängliga stereology apparatur. Jämförbara cell nummer hittades med hjälp av detta protokoll och stereology enheten, vilket visar att detta protokoll för opartisk stereology precision.
Introduction
Kvantifiering av antalet neuronala celler är avgörande i prekliniska Parkinsons Sjukdomforskning för att avgöra nivån på neurodegeneration inom det substantia nigra (SN)1,2. Opartisk beteendetester uppskattning av antalet celler i ett område av intresse anses vara den gyllene standard3,4,5.
Före tillkomsten av opartisk stereology uppskattades antalet neuroner i sektioner genom att manipulera räknade cell profiler att korrigera för variabel sannolikheterna att nervceller kommer i sikte i ett avsnitt. En av de vanligaste metoderna var korrigering av kvantifierade blodkroppar som beskrivs av Abercrombie6. Denna metod försökte ta hänsyn till att celler kan kvantifieras mer än en gång om fragment av samma cell finns i intilliggande tunnslip. Därför, Abercrombie och andra författare genereras ekvationer som krävs antaganden om form, storlek och orientering av räknade celler7,8. Dessa antaganden var dock oftast inte insett och därför ledde till systematiska fel och avvikelser från den faktiska mobilnummer (dvs bias). Bias kunde dessutom inte minskas med ytterligare provtagning3.
För beteendetester uppskattning av cell nummer med hjälp av den optiska naftafraktioneringskolonn, tillämpas matematiska principer för att direkt beräkna den cell nummer direkt i en definierad, 3-dimensionell volym. Fördelen med denna metod är att det inte innebär antaganden om form, storlek och orientering av cellerna räknas. Således, de uppskattade cell nummer är närmare sanna värden och komma närmare stickprovsstorleken ökar (dvs opartisk)3. Eftersom många regler måste följas när du använder stereology för att hålla metoden opartisk, klar att använda kommersiella stereology system har utvecklats (för granskning, se Schmitz och Hof, 20054). Specialiserade stereology system implementera design-baserade beteendetester metoder med en priori definierats sonder och provtagning system för beteendetester bedömningar som leder till självständighet från form, storlek, rumslig fördelning och orientering av den celler att vara analyserade4,9. Kommersiellt tillgängliga stereology system är dock dyra; Detta kan begränsa genomförandet i ny forskning.
Syftet med denna studie var att utveckla en användbar teknik för design-baserade beteendetester uppskattning av dopaminerga blodkroppar i musen SN, anställa den optiska naftafraktioneringskolonn metoden och använder standard mikroskopi utrustning (dvs ljus Mikroskop, standard Mikroskop programvara och en motoriserad x, y, z skede). För detta presenteras en steg för steg guide om hur att bearbeta mus hjärnvävnad och uppskatta SN cell nummer med hjälp av design-baserade opartisk stereology. Dessutom finns mallar för beräkningen av det uppskattade cellantal och koefficienter av fel (CE).
Den metod som beskrivs här är inte begränsat till analysen av SN, men kan anpassas för användning i andra anatomiskt definierade regioner av hjärnan som mus eller råtta. Opartisk stereology har exempelvis använts för att uppskatta neuronala cell nummer i hippocampus10 och locus coeruleus11. Dessutom kan celltyper än neuroner, såsom astrocyter12 och mikroglia13, bedömas liksom. Denna metod kan därför användbar till forskare som avser att genomföra opartisk stereology i deras forskning men är inte villig att spendera en massa pengar att köpa ett stereology system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology börjar med vävnad behandling. Seriell styckning av SN vävnad måste utföras noga för att förhindra förlust av sektioner under beteendetester analys. Dessutom är ett viktigt steg att markera en halvklotet för att skilja höger från vänster SN när du utför stereology. Att placera ett litet hål på den övre delen av hjärnstammen genereras de bästa resultaten i studien presenteras. Dessutom sedan arbetar med optisk naftafraktioneringskolonn metod krav att vävnaden är skuren i tjocka delar av ca …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma mot Keali Röhm, Louisa Frieß och Heike Menzel för deras teknisk experthjälp; att Helga Brünner för djurens vård; och att Chistopher S. Ward för generering och distribution av den optiska disector rutnät plugin för programmet ImageJ.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. 신경과학. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. 신경과학. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
