क्षैतिज पूरे माउंट: मोटा, तीन आयामी ऊतक के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल

Summary

यह काम मोम, तीन आयामी ऊतक क्रॉस-सेक्शन विश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो कन्फोकल इमेजिंग रूपरेखाओं का पूरा शोषण करने में सक्षम होता है। यह प्रोटोकॉल प्रतिजन को सुरक्षित रखता है और त्वचा की ऊतक विज्ञान और संभावित अन्य ऊतक प्रकारों का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है।

Abstract

एक सूक्ष्म चित्र उत्पन्न करने के लिए ब्याज की एक ऊतक संसाधित करना जो वैज्ञानिक तर्क को समर्थन देता है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले सूक्ष्म चित्रों का अधिग्रहण पूरी तरह से माइक्रोस्कोप की गुणवत्ता पर निर्भर नहीं है, बल्कि ऊतक प्रसंस्करण के तरीकों पर भी होता है, जिसमें अक्सर कई महत्वपूर्ण कार्य या कदम शामिल होते हैं। इसके अलावा, त्वचा और अन्य ऊतकों में mesenchymal सेल प्रकार ऊतक की तैयारी और इमेजिंग के लिए एक नई चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां, हम ऊतक फसल से माइक्रोस्कोपी तक पूरी प्रक्रिया पेश करते हैं। हमारी तकनीक, जिसे "क्षैतिज पूरे माउंट" कहा जाता है, एक है कि नौसिखिया जल्दी से कुशल हो सकते हैं और जो क्रिस्टोस्ट के साथ 60-300 माइक्रोन-मोटे वर्गों में प्रतिजन संरक्षण और पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस मोटाई के अनुभागों को तीन आयामी परिवेश में ऊतक माइक्रोआर्किटेक्चर के विस्तारित दृश्य प्रदान किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल मेसेनकाइमल कोशिकाओं को ऐसे तरीके से सुरक्षित रखता है जो छवि गुणवत्ता बढ़ाता है जबमानक क्रिस्टेट या पैराफिन वर्गों की तुलना में, जिससे इम्यूनोस्टेन्सी की प्रभावकारीता और विश्वसनीयता बढ़ती जा रही है। हम मानते हैं कि इस प्रोटोकॉल ने सभी प्रयोगशालाओं को लाभ दिलाया है जो त्वचा को कल्पना करते हैं, और संभवत: अन्य ऊतकों और अंगों।

Introduction

सूक्ष्म इमेजिंग उपकरणों की क्रांति परिष्कृत, उच्च संकल्प इमेजिंग उपकरणों के लिए प्रदान करता है। हालांकि, जब एक पूर्ण तीन-आयामी (3 डी) ऊतक क्रॉस-सेक्शन की सूक्ष्म छवि प्राप्त होती है, नमूना तैयार करने में काफी चुनौतियां होती हैं और छवि गुणवत्ता को परिभाषित करने में सीमित कारक हो सकता है। प्रसंस्करण प्रेरित कलाकृतियों को कम करने और अंतिम छवि गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए प्रत्येक अलग कदम को टिशू आकारिकी और लक्ष्य प्रोटीनों की प्रतिजनता को संरक्षित करने के लिए सावधानीपूर्वक विचार करना चाहिए। उदाहरण के लिए, त्वचा के पारंपरिक विश्लेषण के लिए त्वचा होमोस्टेसिस ^{1 , 2} में स्टेम कोशिका डिब्बेशन योगदान के शारीरिक विश्लेषण के लिए अनुमति देने वाले बाल follicles के साथ, एपिडर्मिस और डेमिस के दृश्य के साथ एक छवि की आवश्यकता होती है। इसके लिए त्वचा को कैसे एम्बेडेड और वर्गीकृत किया गया है, यह पूरी तरह से एकाग्रता की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण रूप से, बाल follicles मोटा हो सकता है100 माइक्रोन से, जो मानक पैराफिन या फ्रोजन सेक्शन मोटाई को बहुत ज्यादा पार करता है, जिसके परिणामस्वरूप पूरे माउंट या मोटे क्रॉस-सेक्शन ^{3 , 4 , 5 के} मुकाबले विश्लेषण का एक कम मानक होता है।

सूक्ष्म विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने के प्रत्येक चरण के साथ, एक महत्वपूर्ण निर्धारक है जो छवि विश्लेषण को प्रभावित करेगा। यहां, मोटी, 3 डी ऊतक क्रॉस-सेक्शन विश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण प्रोटोकॉल, जिसे हम "क्षैतिज पूरे माउंट" कहते हैं, प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल अत्यधिक एंटीजेनेसिटी को सुरक्षित रखता है और मानक confocal इमेजिंग उपकरण का उपयोग करके त्वचा के मोटे हिस्से का पूरा शोषण सक्षम बनाता है। यह ऊतक ऊतक क्रॉस-सेक्शन प्रसंस्करण और इमेजिंग के लिए त्वचा का उपयोग करने के लिए एक पूर्ण गाइड है, जिसमें ऊतक फसल और पैराफॉर्मालाहैड (पीएफए) -सॉस्टेड क्रियोप्रेजेशन (चरण 1), क्रिस्टोस्ट (चरण) के साथ 100 माइक्रोन-मोटी ऊतक क्रॉस-सेक्शन 2), और immunofluorescent लेबलिंग और बढ़ते (चरण 3 और 4)। प्रतिनिधि परिणाम दो अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल तैयारी तकनीकों- शास्त्रीय cryosectioning और मोटी, 3 डी ऊतक क्रॉस-सेक्शनिंग की confocal छवियों की तुलना करें- इस प्रोटोकॉल के संभावित उपयोगकर्ता के लिए "क्षैतिज पूरे माउंट" के फायदे को उजागर करते हैं।

Protocol

सभी पशु प्रयोग स्थानीय नैतिक अनुमोदन के अधीन थे और यूके सरकार होम ऑफिस लाइसेंस की शर्तों के तहत किया गया था। 1. त्वचा हार्वेस्ट और क्रियोपेशेशेशन तैयारी। 25 एमएल की 4% पीएफए ​​और 2 एमएम की 1 एम 2 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) के साथ एक 100 मिमी संस्कृति डिश तैयार करें। इष्टतम काटने के तापमान परिसर (ओसीटी) के साथ दो-तिहाई से आयताकार छील-दूर cryomolds भरें। एक धातु प्लेट रखें, जिस पर बाद के चरण में cryoblocks को रखा जा सकता है, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में। त्वचा कटाई, निर्धारण, और क्रियोपेशेशेशन एक शुष्क इलेक्ट्रिक शेवर के साथ पशु शव के पृष्ठीय क्षेत्र को क्लिप करें। नोट: इस उदाहरण में, प्रसवोत्तर दिन 21 वायलटिप चूहों का इस्तेमाल किया गया था। त्वचा पर ब्याज के क्षेत्रों काटा लें नोट: माउस त्वचा के dorsomedial क्षेत्र ( <stronG class = "xfig"> चित्रा 1 ए) में बालों के रोम की उच्चतम प्रतिशत होती है जो एक समान दूरी और गठबंधन होती है, जो सेक्शनिंग के लिए इष्टतम अभिविन्यास के लिए अनुमति देता है। अंतर्निहित गैर-त्वचीय ऊतक को हटाने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यदि आवश्यक हो तो किया जा सकता है। कणों के कण में फिट होने के लिए उचित आकार के आयताकार टुकड़ों में काटा हुआ त्वचा को छाँटो, बाल कूप के अनाज की दिशात्मक वृद्धि को ध्यान में रखते हुए। नोट: नवप्रवर्तनों के लिए छोटी त्वचा के स्लाइस को संभालना आसान हो सकता है, क्योंकि ऊष्मायन और बढ़ते हुए प्रक्रिया के दौरान वे कम होने की संभावना नहीं रखते हैं। यहां दिखाया गया उदाहरण पृष्ठीय त्वचा का ~ 1 सेमी 2 क्षेत्र है, जो 22 x 30 x 20 मिमी क्रोनोल्ड ( चित्रा 2 ए ) में फिट बैठता है। त्वचा के नमूने ( चित्रा 1 बी ) की मोटाई के आधार पर, कमरे के तापमान पर त्वचा को 10-30 मिनट के लिए 4 एमएम पीएफए ​​में ठीक करें। पीबीएस के 25 एमएल में त्वचा के नमूने दो बार धो लेंकम से कम 5 मिनट प्रत्येक के लिए ( चित्रा 1 बी ) सावधानीपूर्वक अतिरिक्त पीबीएस के ऊतक को निकालने के लिए पेपर तौलिया पर त्वचा के नमूनों को दबाएं, जो ठंड प्रक्रिया के दौरान क्रिस्टलीकरण के परिणामस्वरूप हो सकता है और क्रोजोसेक्शनिंग परिणाम को प्रभावित कर सकता है। नोट: एक मानक सूक्रोज़ ढाल की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, यह उपयोगकर्ता के विवेक पर प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है। प्रत्येक त्वचा के नमूने के लिए बाल follicles के उन्मुखीकरण से अवगत रहें। दृश्य सहायता के लिए विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (विशेषकर पहली बार किसी भी व्यक्ति को प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करना) ओसीटी से भरे क्रायोमोल्ड में त्वचा के नमूने को सम्मिलित करें और ओसीटी के साथ त्वचा के सभी क्षेत्रों को संदंश ( आंकड़े 2 ए और 2 बी ) का उपयोग करके क्लिप्टेड बालों की सतह से जुड़ी किसी भी हवाई बुलबुले को हटा दें। ओसीटी भरा ब्लॉक के नीचे त्वचा को पुश करें ताकि यह नीचे के साथ फ्लश हो। नोट: त्वचा किसी भी दिशा में उन्मुख हो सकती है, एचूंकि बाल कूप का अनाज उपयुक्त काटने की प्रक्रिया के लिए जाना जाता है क्रोनोल्ड्स को फिर से उन्मुख किया जाएगा, जब cryosactioning के लिए ब्लॉक cryostat से जुड़े होते हैं। क्रायोमॉल्ड पर बाल कूप अभिविन्यास को चिह्नित करें, क्योंकि यह चरण क्रिस्टोस्ट कट के बाद की ओर उन्मुखीकरण निर्धारित करता है। ऊतक के फ्लोटिंग और अव्यवस्था से बचने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में धातु प्लेट पर क्रियोब्लॉक्स् स्थानांतरण करें। क्रोनोल्ड के तल पर त्वचा की ओरिएंटेशन को बनाए रखने के लिए ठंड प्रक्रिया की निगरानी करें, क्योंकि अनदेखी हवा के बुलबुले में रोमन cryomold की सतह तक बढ़ सकता है। नोट: जमे हुए ऊतकों के साथ क्रोलॉल्ड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर एक वर्ष से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकता है और अतिरिक्त वर्गों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 1 चित्रा 1. फसल और माउस त्वचा का निर्धारण। </stroएनजी> ( ए ) पशु ऊतक को पशु शव के डरोसाइडियल क्षेत्र से काटा गया था। इस क्षेत्र में बाल follicles समान रूप से अंतर और गठबंधन किया जाता है और इसलिए तीर के दौरान इष्टतम अभिविन्यास के लिए अनुमति देते हैं, जैसा कि तीरों द्वारा दर्शाया गया है। ( बी ) क्रोनोल्ड में फिट होने वाले किसी उपयुक्त आकार के चौराहों को काटने के बाद, त्वचा के ऊतकों को 4% पीएफए ​​में 15 मिनट में तय किया गया था और पीबीएस में दो बार प्रत्येक 5 मिनट के लिए धोया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें 2. मोटा ऊतक क्रॉस-सेक्शनिंग क्रिस्टोस्ट पर माउंट करने के लिए तैयारी और ऊतक ओरिएंटेशन। पीबीएस के 15 एमएल के साथ एक 100 मिमी संस्कृति डिश तैयार करें। इसे क्रिस्टोस्ट पर एक आसानी से सुलभ क्षेत्र पर रखें। इसके अलावा, अच्छी तरह से पीबीएस के 2.5 एमएल के साथ एक 12-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें; एसई के दीर्घकालिक भंडारण के लिए नमूने के अनुसार लेबलसीमेंट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को संभालने के लिए संदंश का उपयोग करें -20 डिग्री सेल्सियस तक क्रिस्टोस्ट का तापमान समायोजित करें नोट: तापमान सेक्शनिंग को प्रभावित कर सकता है, लेकिन एक अच्छा मार्गदर्शन -20 डिग्री सेल्सियस से शुरू करना है वर्गों को प्राप्त करने के लिए लगभग दो बाल follicles मोटी, cryostat समायोजित करने के लिए 150 μm मोटी वर्गों में कटौती नोट: उपयोगकर्ता की जरूरतों और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप की सीमाओं के आधार पर, अनुभाग की मोटाई अलग-अलग हो सकती है। नोट: नमूना का अभिविन्यास उचित दिशा-निर्देश में बालों के रोम के साथ त्वचा के वर्गों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह cryostat ब्लॉक पर ठीक से बढ़ते द्वारा प्राप्त किया जाता है। सुनिश्चित करें कि अनुभाग विमान बाल कूप उन्मुखीकरण ( चित्रा 2 सी ) के समानांतर है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, त्वचा के नमूने में अनुभाग विमान का सही अभिविन्यास उन चित्रों की गुणवत्ता का निर्धारण करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, जिसमें प्राप्त किया जाएगाएक बाद का कदम चित्रा 2. एम्बेडिंग, क्रियोपेशेशेशन और सेक्शनिंग ( ए ) क्रोनोल्ड पर बाल कूप (एचएफ) की दिशा को चिह्नित करते हुए, काले तीर द्वारा इंगित किया जाता है, cryosectioning के दौरान उचित अभिविन्यास के लिए महत्वपूर्ण है। ( बी ) अनुभाग विमान को बालों के कूप उन्मुखीकरण के साथ गठबंधन की आवश्यकता होती है, जिसमें वर्गों को उत्पन्न करने के लिए बाल follicles की पूरी लंबाई बरकरार रहती है। ( सी ) बाल कूप उन्मुखीकरण प्रति अनुभाग काट दिया गया था जो कि काले तीरों से संकेत दिया गया था। cryomold। ( डी ) मोटी ऊतक के पार-वर्गों को धातु संदंश के साथ एकत्र किया गया था और ( ई ) 1 मिमी पीबीएस युक्त 100 मिमी संस्कृति वाले डिवाइन में स्थानांतरित कर दिया गया था। ( च ) कमरे के तापमान पर, पीबीएस ने ओसी को दूर कर दियाटी। मिश्रित जो मोटे ऊतक के पार-वर्गों के चारों ओर से घेरे हैं, जैसा कि सफेद तीरों द्वारा दर्शाया गया है। तब अनुभाग पीबीएस में स्वतंत्र रूप से फ्लोट करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें Cryosectioning। क्रिस्टोस्ट का उपयोग करके एक अनुभाग कट करें ओसीटी को इकट्ठा करने के लिए संदंश का प्रयोग करें जिसमें त्वचा के एम्बेडेड टुकड़े ( चित्रा 2 डी ) शामिल हैं। नोट: एक cryostat का प्रयोग करें जो इष्टतम नमूना स्थिति के लिए एक्स, वाई, और जेड अक्षों के साथ स्वतंत्र आंदोलन और समायोजन को सक्षम करता है। यह आदर्श रूप से गठबंधन वाले ऊतक क्रॉस-सेक्शन की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। पीओएस से भरा 100 मिमी संस्कृति डिश में क्रिस्टोस्ट से बाहर अनुभाग स्थानांतरण करें और अगले स्लाइस के साथ जारी रखें। एक स्लाइड पर नमूने एकत्रित न करें ( चित्रा 2e )। नोट: कमरे के तापमान पर, पीबीएस दूर भंग होगाओसीटी, त्वचा के स्लाइस को छोड़कर जो संदंश ( चित्रा 2f ) के साथ संभाल करने में आसान है। नोट: 100 एमएम संस्कृति डिश में कई ऊतक वर्गों 100 μm मोटे भंग के बाद ताजा पीबीएस की आवश्यकता हो सकती है और तदनुसार बदला जा सकता है। अस्थायी त्वचा वर्गों को ठीक से लेबल की जाने वाली 12 अच्छी तरह से प्लेट में 2.5 एमएल पीबीएस ( चित्रा 3 ए , बाएं) से भरने के लिए संदंश का उपयोग करें। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर, कम से कम दो दिनों के लिए नमूने संग्रहीत किया जा सकता है। सेक्शनिंग के बाद त्वचा युक्त ओसीटी ब्लॉक के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, ताजा ओटीटी की छोटी बूंद के साथ काटने की सतह को सील करें, ओसीटी छोटी बूंद को ठंड के बाद, पैराफिल्म में उपयोग किए गए ओसीटी ब्लॉक लपेटें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में रख दें । 3. Immunofluorescent लेबलिंग लीब पर पीबी बफर (0.5% स्किम दूध पाउडर, 0.25% मछली त्वचा जिलेटिन और 0.5% ट्राइटन एक्स -100) के साथ पीबी बफर तैयार करें।टी 2 एच अग्रिम में, जैसा कि पहले 5 वर्णित है नोट: धुंधला बफर के दोहराया उपयोग के लिए एंटीबॉडी संरक्षण के लिए पीबी बफर में सोडियम एजाइड को जोड़ा जा सकता है। 1.5 एमएल माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों को लेबल करें और पीबी बफर प्रति ट्यूब 500 μL जोड़ें। पीबीएस से त्वचा के टुकड़ों को अलग-अलग ट्यूबों में अवरुद्ध करने के लिए पीबी बफर से स्थानांतरित करने के लिए सावधानी से संदंश का उपयोग करें ( चित्रा 3 ए , दाएं)। सुनिश्चित करें कि सभी त्वचा के स्लाइसें पूरी तरह से जलमग्न हैं। एक देखे हुए झूली कुरसी पर microcentrifuge ट्यूबों को प्रति मिनट 10 ओसीलेसमेंट से अधिक गति पर रखें, जो कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टिशू अखंडता को बाधित नहीं करना चाहिए। नोट: यह जरूरी है कि गति-दर-दृश्य वाले घुमाव पर गति प्रति मिनट 10 ऑक्सिलेशन से अधिक न हो, क्योंकि यह टेंगलिंग को प्रेरित करेगा। एंटीबॉडी को बचाने के लिए, एक माइक्रोसॉसिप्रूग्यू ट्यूब प्रति एक से अधिक टुकड़ा जोड़ना संभव है, केवल एक टुकड़ा प्रति ट्यूब रखें। एंटीबॉडी उपयोग कम करने के लिए, एक मात्रा का उपयोग करें250 μL का नोट: यदि आवश्यक हो, तो माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूबों के साथ, उदाहरण के लिए, 96-अच्छी तरह प्लेटें। हालांकि, 1.5-एमएल माइक्रोसेंटप्रू्यूज ट्यूबों में मोटी ऊतक क्रॉस-सेक्शन का स्थान बढ़ाकर तरल उलझन के कारण ऊतकों में सबसे प्रभावी एंटीबॉडी पैठ के लिए अनुमति देता है। प्रत्येक त्वचा के स्लाइस के लिए अलग 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों लेबल और पीबी बफर के 500 μL और प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित मात्रा में जोड़ें। अवरुद्ध करने के 1 घंटे के बाद, त्वचा के स्लाइस को एंटीबॉडी युक्त ताजे तैयार ट्यूबों में स्थानांतरित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइस सेते हैं। नोट: इस उदाहरण में, निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था: 1:50 की एकाग्रता में एफआईटीसी चूहे विरोधी मानव सीडी 49 एफ और 1: 100 की एकाग्रता में बकरी एंटी-माउस / चूहा एक्टिनिन अल्फा 8। अगले दिन प्रति नमूने 500 μL पीबीएस वाले दो अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूब तैयार करें। कमरे के तापमान को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान में दो बार धो लेंई। प्रयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के उचित एकाग्रता और 4 ', 6-डायरीडिनो-2-फेनिलंडोल (डीएपीआई) के साथ पीबी बफर के 500 μL युक्त 1.5 एमएल माइक्रोप्रतिय्यूज ट्यूबों को अलग करें। नोट: इस उदाहरण में प्रयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लूर 488 गधा एंटी-चूहा आईजीजी और एलेक्सा फ्लोरा 555 गधा विरोधी बकरी आईजीजी 1: 500 की एकाग्रता में है। डीएपीआई 1: 100 की एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था। ध्यान से त्वचा के नमूनों को पीबी बफर में स्थानांतरित करें, जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी और डीएपीआई शामिल है, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक चक्करदार या प्रकार के बरतन पर कम गति से त्वचा के स्लाइस सेते हैं। पीबी बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस स्टोर करें जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी और डीएपीआई को चार दिनों तक और संभवतः अब जब सोडियम एजाइड पीबीएस में जोड़ा जाता है। चित्रा 3 चित्रा 3. Immunofluorescएंट लेबलिंग और माउंटिंग ( ए ) फ्लोटिंग ऊतक क्रॉस-सेक्शन को 12-अच्छी तरह प्लेट्स में कम से कम दो दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंट (IF) लेबलिंग से पहले, 1 एमबी माइक्रोसॉसिफ्यूज ट्यूबों में रुचि के ऊतक क्रॉस-सेक्शन को अवरुद्ध करने के लिए पीबी बफर में स्थानांतरित करें, जैसा कि तीर 1 द्वारा दिखाया गया है। लेबलिंग के लिए, चरण 3 में विस्तारित बहु-प्रक्रिया प्रक्रिया का पालन करें। प्रत्येक चरण 3 के भाग के लिए ऊतक क्रॉस-सेक्शन के सावधानीपूर्वक हस्तांतरण की आवश्यकता होती है जो ताजे तैयार माइक्रोप्रोक्सीव ट्यूबों में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान, या वॉशिंग बफर युक्त होते हैं, जो कि तीर 2 द्वारा दर्शाया गया है। ( बी ) लेबलिंग के बाद, ऊतक क्रॉस- एक विदारक सूक्ष्मदर्शी की सहायता से, अनुभाग ग्लिसरॉल की एक छोटी बूंद में सुलझ गए हैं और चपटे हैं। ( सी ) एक बार ऊतक क्रॉस-सेक्शन पूरी तरह से एक कवर पर्ची के नीचे चपटा हुआ है, तो एक नियमित माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग अनुभाग को माउंट करने के लिए किया जाता है। <aHref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 4. माइक्रोस्कोपिक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बढ़ते हुए इमेजिंग से पहले, सेकेंडरी एंटीबॉडी और डीएपीआई को धोने के लिए पीबीएस के 500 μL युक्त माइक्रो-ट्रांससेफ्यूज ट्यूबों को अलग करने के लिए त्वचा के टुकड़ों को स्थानांतरित करें। 1,000 μL pipet का उपयोग करें, लेकिन अत्यधिक चिपचिपा ग्लिसरॉल की उचित pipetting सक्षम करने के लिए विंदुक टिप के पहले 0.5 सेमी काट। एक विदारक माइक्रोस्कोप ( चित्रा 3 बी ) के तहत एक अंधेरे पृष्ठभूमि पर एक 22 x 50 मिमी coverslip रखें। कवर पर्ची पर 100% ग्लिसरॉल की एक छोटी बूंद जोड़ें ( चित्रा 3 बी )। ग्लिसरॉल छोटी बूंद पर सूक्ष्मदर्शी ट्यूब से त्वचा का टुकड़ा स्थानांतरण करें। विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें और संदंश की ओर इशारा किया जाता है ताकि त्वचा के स्लाइस को ध्यान से खोलें जो कर्ल कर रहे हैं। नोट: के रूप में टुकड़ा gly में तैरता हैसीरोल छोटी बूंद, यह ऊतक की प्राकृतिक प्रवृत्ति को अपने सामान्य आकार पर वापस लौटाने से गुदगुदी हो सकती है। टुकड़े के अप्राकृतिक सीधे को बल न दें, क्योंकि इससे ऊतक को नुकसान हो सकता है। ऊतक को माउंट करें एक बार त्वचा खंड की पूरी लंबाई ठीक से उन्मुख और कवर पर्ची पर चपटा हुआ है; नियमित माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करें यह कदम आगे त्वचा का टुकड़ा सीधा होगा नोट: हवा में फंसने से बचें ( चित्रा 3 सी )। अगले दो दिनों में ग्लिसरॉल-माउंटेड त्वचा वाले हिस्से में छवि। नोट: लंबे समय तक भंडारण नकारात्मक ऊतक और इमेजिंग गुणवत्ता को प्रभावित करेगा। इस उदाहरण में, सभी छवियों को एक 20x उद्देश्य का उपयोग करके एक ईमानदार confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ अधिग्रहण किया गया था।

Representative Results

हमारी तकनीक के फायदे पर ज़ोर डालने के लिए, हमने अपनी मोटी, 3 डी ऊतक क्रोस-सेक्शनिंग तकनीक की तुलना की, "क्षैतिज पूरे माउंट," शास्त्रीय जमे हुए वर्गों के लिए। शास्त्रीय जमे हुए वर्गों को पहले वर्णित 5 के रूप में कट गया था। इन सूक्ष्मदर्शी छवियों में एपिडर्मिस के लिए एक दृश्य संरचना प्रदान करने के लिए, हम अखंड-अल्फा -6 (इटागा 6) के लिए immunostained, जो एक घटक है जो अंतर्निहित तहखाने झिल्ली 6 के लिए एपिडर्मल कोशिकाओं को लंगर करता है। हमने आरेंटर पिली मांसपेशियों (एपीएम) को भी लेबल किया, जो कि पायलोएक्शन के लिए जिम्मेदार है (जिसे "गूज़बंप्स" भी कहा जाता है), साथ में अल्फाइन -8 7 के साथ । शास्त्रीय जमे हुए वर्गों में, इटैगा के साथ देखने वाले ज्यादातर बाल follicles पूरे लंबाई के साथ नहीं बांटे गए थे, क्षैतिज पूरे माउंटों की तुलना में, प्रति अनुभाग में मुख्य रूप से अधूरे बाल follicles पैदा करते हैं ( चित्रा 4 ए -4 डी </strong>)। मोटी ऊतक क्रॉस-सेक्शन, पारंपरिक 10-माइक्रोन के वर्गों की तुलना में अधिक Z स्टैक परतों को प्राप्त करना संभव बनाता है, जो कि एक अधिक पूर्ण 3 डी छवि के लिए अनुमति देता है। यह एपीएम की अखंडता का अध्ययन करते समय यह और भी अधिक स्पष्ट हो जाता है, जो बालों के रोम और ओवरलेस तहखाने झिल्ली से जुड़े हैं। शास्त्रीय cryosections में, एपीएम के विशाल भाग अंश थे ( चित्रा 4a-4 डी )। इसके अतिरिक्त, हाइपोडर्मल कम्पार्टमेंट की ऊतक अखंडता क्षैतिज पूरे माउंट में संरक्षित होती है, जब एडीओपोसाइट्स के विनाश की तुलना में क्रोसजेक्शन गर्म कांच की स्लाइड्स से जुड़ी होती है, जो कि प्रसिद्ध फ्रीज-थॉविंग आर्टिफैक्ट ( चित्रा 4 ए- बी , हाइपोडर्माल की तुलना करती है) क्षेत्रों) 8 चित्रा 4. क्षैतिज पूरे मौएक शास्त्रीय cryosection की तुलना में NT। ( ए ) 10 μm मोटे तौर पर प्राप्त किया गया त्वचा की रोशनी 10% से अधिक होती है और ( बी ) 100 माइक्रोन-मोटी 3 डी ऊतक क्रॉस-सेक्शन को एपिडर्मल कम्पार्टमेंट और आर्रेक्टर पिली मांसपेशियों को देखने के लिए इंटीग्रिन अल्फा -6 (इटागा 6) और इंटीग्रिन अल्फा -8 (इटागा 8) के साथ लेबल किया गया था , क्रमशः मोटी ऊतक क्रॉस-सेक्शन की छवियों को बड़े जेड स्टाक के अधिकतम अनुमान के रूप में दर्शाया जाता है। सफेद फ्रेम उन क्षेत्रों को इंगित करते हैं जो विस्तारित होते हैं, ( सी ) शास्त्रीय और ( डी ) क्षैतिज पूरे पर्वत वर्गों में प्रदर्शित होते हैं। ( ई ) बरकरार बाल follicles और ( च ) बरकरार धमनी करनेवाला पिली मांसपेशियों दोनों शास्त्रीय और क्षैतिज पूरे माउंट वर्गों में मात्रा निर्धारित किया गया। स्केल बार 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। डेटा को माध्य (एसईएम) के मानक त्रुटि के रूप में दर्शाया गया है। प्रति जैविक प्रतिलिपि एक खंड ( एन = 3) मात्रा निर्धारित किया गया था। अनपेक्षित टी-परीक्षण * पी <0.05, *** पी <0.0005 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

Here, we present the “horizontal whole mount” technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))⁹ are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies ^2,10.

Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure^2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines¹⁴. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

Materials

PBS			homemade
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma	G7765	250ML
Glycerol	BDH Laboratory Supplies	444482V
O.C.T. compound	VWR chemicals	361603E
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS	Square S-22
Non-Fat Powdered Milk	Bio Basic Inc.	NB0669
Triton X-100	Sigma	T9284	500ML
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
FITC Rat Anti-Human CD49f	BD Pharmingen	555735
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody	R&D Systems	AF4076
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG	Life Technologies	A21208
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG	Life Technologies	A21432
CryoStar NX70	Thermo Fisher Scientific
100mm Culture dishes
Disposable scalpels	Swann-Morton	Ref 0501
pointed metal forceps
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR	211-2130
12 Well plates	Sigma	CLS3513
Dissecting microscope	Nikon
20 ul and 1000 ul Pipette	Gilson
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1122-1830
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1120-1810
Rocking shaker plate
Microscope slides, menzel Glaeser	Thermos Scientific	631-9483	Superfrost Plus
Cover Glasses, Menzel Glaeser	Thermos Scientific	MENZBB024060AB	24 x 60 mm
Confocal microscope	Nikon