Her presenterer vi adresserbare slippverktøy microarrays (ADMs), en dråpe matrise basert metode finne absolutt protein overflod i enkeltceller. Vi demonstrere evnen ADMs å karakterisere heterogenitet i uttrykket av tumor suppressor protein p53 i en menneskelig kreft cellen linje.
Ofte mobilnettet atferd og mobilnettet svar analyseres på befolkningsnivå der svarene på mange celler er samlet sammen som en gjennomsnittlig resultat maskering rik enkeltcelle virkemåten i komplekse innbyggere. Enkelt celle proteinet oppdagelsen og kvantifisering teknologi har gjort en bemerkelsesverdig innvirkning de siste årene. Her beskriver vi en praktisk og fleksibelt enkelt celle analyse plattform basert på adresserbare slippverktøy microarrays. Denne studien beskriver hvordan absolutt kopi antall mål proteiner kan måles med enkeltcelle oppløsning. Tumor suppressor p53 er vanligvis muterte genet menneskelige kreft, med mer enn 50% av totale krefttilfeller viser et ikke sunt p53 uttrykksmønster. Protokollen beskriver fremgangsmåten for å opprette 10 nL dråper som enkelt menneskelige celler er isolert og kopien antall p53 protein måles med ett molekyl oppløsning du nøyaktig finne variasjon i uttrykk. Metoden kan brukes på en celle type inkludert primære materiale til å fastslå hvor absolutt kopi av alle mål proteiner av interesse.
Målet med denne metoden er å avgjøre variasjonen i overflod av et mål protein i en celle befolkningen med enkeltcelle oppløsning. Enkelt celle analyse gir en rekke fordeler som ikke er tilgjengelig med tradisjonelle ensemble biokjemiske metoder. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 det første, arbeider på enkeltcelle nivå kan ta den rike mangfold i celle innbyggere som ellers ville gå tapt ved den snitt som oppstår med tradisjonelle ensemble biokjemiske teknikker. Flertallet av verk-hest biokjemiske metoder fungerer med bulk, krever, som de ofte gjør, millioner av celler til å produsere et resultat. Selvfølgelig konsekvensene av vurdere hele celle populasjoner avhenger av flere faktorer, for eksempel heterogenitet i protein uttrykk der noen viktige funksjoner i fordelingen av protein overflod kan bli savnet. Fra et praktisk perspektiv, følsomheten kreves av enkeltcelle teknikker gjør dem i stand til å arbeide med mengder av biologisk materiale som er tilstrekkelig for enda mer følsomme bulk teknikker å fungere. Et sentralt eksempel på dette er studiet av sjeldne celletyper som sirkulerer kreftceller (CTCs) hvor selv for pasienter med en dårlig prognostiske outlook trekke mindre enn 10 CTCs kan finnes i en enkelt 7,5 mL blod. 6 Her presenterer vi metodikken kreves for å utføre enkeltcelle protein mål med en redusert volum antistoff-baserte analysen ansette olje-capped dråper trykt på et antistoff microarray.
Microfluidic slippverktøy plattformer er høy gjennomstrømning, kunne generere tusenvis av dråper per sekund, og i stand til å isolere, og selv dyrking, enkeltceller i individuelle dråper til å utføre en rekke biokjemiske analyser. Slippverktøy-baserte teknikker er godt egnet for enkelt celle analyse,7,8,9 med kjente nyere eksempler inkludert DropSeq10 og inDrop11, som har vært sterkt hjulpet av makt forsterkning teknikker. Begrenset mengde materiale og ingen av metodene av forsterkning for proteiner gjør enkeltcelle Proteomikk spesielt utfordrende.
Dråper kan analyseres av en rekke metoder og fluorescens mikroskopi er blitt vidt anvendt. Ett molekyl teknikker som totalt interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kan fluorescerende molekyler til visualiseres med enestående signal-til-støy-forhold. 12 på grunn av eksponentiell forfallet av feltet evanescent, bare fluorophores i høy nærhet til overflaten (for 100nm) er glade gjør TIRF en god strategi i å oppdage små mengder av et mål molekylet i en kompleks blanding. Iboende optisk snitting styrken på TIRF også bidrar til å unngå vask trinnene og grenser analysen tid og kompleksitet. Men TIRF krever ut flater og eksempler på TIRF mikroskopi på dråper i flyt innebærer dannelsen av en plan overflate som bildet. 13 dette enkelt celle proteomic teknikker ofte design microfluidic brikker rundt overflaten-immobilized fange agenter i et microarray format. 4 , 14
Dråpene, selv, kan dannes i matriser på Plane overflater, såkalte slippverktøy microarrays. 15 , 16 , 17 romlig organisering dråper til matriser tillater dem å beleilig indekseres, lett over tid, individuelt adresserte og, hvis nødvendig. Slippverktøy microarrays kan oppnå en høy tetthet av mikro-reaktorer med tusenvis av elementer per brikke som er frittstående eller støttes av microwell. 18 , 19 , 20 de kan bli dannet av sekvensiell deponering av flytende håndtering roboter, inkjet spotters, kontakt microarrayers21,22,23,24,25, 26 , eller de kan selv montere på overflater som superhydrophillic flekker mønstret på en superhydrophobic overflate. 27 , 28 , 29
Med disse betraktninger i tankene, ble adresserbare slippverktøy Microarrays (ADMs) utviklet for å kombinere allsidighet, romlig adresserbarhet og reduserte mengder slippverktøy microarrays med sensitiviteten av ett molekyl TIRF mikroskopi til kvantitativt måle protein overflod. 5 ADMs kan enkelt celle analyse danner et slippverktøy microarray inneholder enkeltceller over et antistoff microarray, som deretter er avkortet med olje å hindre fordampning. Volum av dråpene er diskret å hindre tap av prøven, som ellers kunne oppnås ved på prosessoren valving i kontinuerlig microfluidics. 30 den absolutte mengden målet protein fra en enkelt celle er ekstremt liten; men lar redusert mengden dråpene for relativt høy lokal konsentrasjon slik at de oppdages ved hjelp av en sandwich antistoff analysen – antistoffer er immobilized i en distinkt region, eller sted, på en overflate som fanger protein som i sin tur binder til en fluorescently merket oppdagelsen antistoff i slippverktøy volumet. Som en etikett-fri tilnærming (i.e. protein mål ikke trenger å være merket direkte), ADMs er generelt gjelder analysere celler fra primærkilder, som behandlet blod, fint må aspirates og dissosiert svulst biopsier, samt celler fra kultur og deres lysates.
Måle variasjonen i protein overflod over en celle befolkningen er heterogenitet svar, for eksempel et stoff og hjelper i å gi innsikt i cellulære funksjoner og veier, vurdere subpopulasjoner og deres atferd samt identifisere sjeldne hendelser som ellers ville bli maskert av bulk metoder. Denne protokollen beskriver hvordan å produsere og bruke adresserbare slippverktøy microarrays å kvantitativt bestemme tettheten av transkripsjon faktor p53 i menneskelige celler og kan brukes til å undersøke hvilken rolle p53 svar på cellegifter. Målet protein bestemmes av fangst og gjenkjenning antistoffer og kan endres for å inkludere mer eller ulike mål. Du finner instruksjoner for å bygge en enkel apparater omfatter en konsentrisk munnstykket fra generell lab forbruksvarer til å manuelt array 10 nL dråper avkortet med olje. Full eksperimentelle prosessen er beskrevet der hver dråpe er så lastet med en enkelt celle, som er så lysed og uttrykk for protein bestemt med ett molekyl oppløsning bruker TIRF mikroskopi.
Adresserbare slippverktøy Microarrays er følsom og utvidbart metoder kvantitativt avgjør hvor absolutt kopi av protein i én celle.
Begrenser grad av ikke-spesifikk binding er (NSB) kritisk i protokollen for å oppnå så lavt en grense på oppdagelsen som mulig. Proteiner og andre biokjemiske arter kan nonspecifically binde til et antall grensesnitt stede i dråpene-dekkglassvæske overflaten, antistoffer spot og olje/vann-grensesnittet. Proteiner gå tapt ved partisjonering i grensesnitte…
The authors have nothing to disclose.
ASR designet eksperimenter, utviklet protokoller og analysert data. SC og PS utført celle størrelsen eksperimenter. ASR og OC skrev manuskriptet. Forfatterne vil takknemlig anerkjenner støtte fra Professor David R. Klug for å gi tilgang til utstyr. Forfatterne ønsker å takke de Imperial College avansert Hackspace for tilgang til fabrikasjon og prototyping fasiliteter.
Cell culture | |||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microarray | |||
Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
Betaine | Sigma | 61962 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Droplets | |||
Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopy & Optics | |||
TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Fiji | Open Source | Image analysis software | |
Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |