Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable
Summary
Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.
Abstract
Comportamiento a menudo celular y respuestas celulares se analizan a nivel de población donde se agruparon las respuestas de muchas células como resultado promedio enmascara el comportamiento rico sola célula dentro de una población compleja. Tecnologías de detección y cuantificación de la proteína unicelular han hecho un impacto notable en los últimos años. Aquí describimos una plataforma de análisis práctico y flexible única célula basada en microarrays gotita direccionable. Este estudio describe cómo los números de copia absoluta de proteínas objetivo pueden medirse con una resolución de única célula. El tumor supresor p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano, con más del 50% total de casos de cáncer exhibiendo un patrón de expresión de p53 no saludables. El protocolo describe los pasos para crear 10 gotitas de nL en el que las células cancerosas humanas solo son aisladas y se mide el número de copias de la proteína p53 con la resolución sola molécula para determinar precisamente la variabilidad en la expresión. El método puede aplicarse a cualquier tipo de células incluyendo el material principal para determinar el número de copia absoluta de cualquier proteínas target de interés.
Introduction
El objetivo de este método es determinar la variación en la abundancia de una proteína de la blanco en una población de células con una resolución de única célula. Análisis de célula proporciona una serie de beneficios que no están disponibles con métodos bioquímicos de formación tradicional. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en primer lugar, trabajar en el nivel unicelular puede capturar la rica heterogeneidad de una población celular que de lo contrario se perdería por el promedio que se produce con técnicas bioquímicas de formación tradicional. La mayoría de los métodos bioquímicos de caballo de trabajo trabaja con la mayor parte, que requieren, como a menudo lo hacen, millones de células para producir un resultado. Por supuesto, las consecuencias de la evaluación de las poblaciones de toda la célula depende de varios factores, por ejemplo, la heterogeneidad en la expresión de la proteína donde pueden perderse algunas características importantes de la distribución de la abundancia de la proteína. Desde una perspectiva práctica, la sensibilidad requiere de técnicas unicelular hacerlos capaces de trabajar con cantidades de material biológico que no es suficiente para incluso las más sensibles a granel técnicas de función. Un ejemplo clave de esto es el estudio de tipos raros de la célula tales como células del tumor (CTC) donde incluso para los pacientes con un pronóstico desalentador pronóstico menos 10 CTC puede estar presente en la sangre solo 7,5 mL sacar de circulación. 6 aquí presentamos la metodología necesaria para realizar las mediciones de proteína unicelular mediante un volumen reducido ensayo basados en anticuerpos empleando gotas aceite tapa impresa en un microarray de anticuerpo.
Plataformas de gota microfluídicos son alto rendimiento, capaz de generar miles de gotas por segundo y capaz de aislar y cultivar incluso, las células en gotas individuales a realizar una amplia gama de Ensayos bioquímicos. Técnicas basadas en la gota son adecuadas para el análisis unicelular,7,8,9 con notables ejemplos recientes incluyendo DropSeq10 y inDrop11, que han sido ayudados grandemente por el poder de técnicas de amplificación. La limitada cantidad de material y no métodos de amplificación para las proteínas hacen única célula proteómica especialmente desafiante.
Gotas pueden ser analizadas por una serie de métodos y microscopía de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado. Sola molécula técnicas como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total permite moléculas fluorescentes para visualizarse con cociente signal-to-noise sin precedentes. 12 debido al decaimiento exponencial del campo evanescente, sólo fluoróforos en gran proximidad a la superficie (orden de 100nm) muy contentos haciendo TIRF una buena estrategia en la detección de pequeñas cantidades de una molécula de la blanco en una mezcla compleja. La fuerza inherente de seccionamiento óptica de TIRF también ayuda a evitar los pasos de lavado y ensayo de límites de tiempo y la complejidad. Sin embargo, TIRF requiere superficies planas y ejemplos de microscopía TIRF aplicado a las gotitas de flujo implican la formación de una superficie plana que a la imagen. 13 para ello, técnicas de proteómica celular solo diseño a menudo chips microfluídicos en agentes de superficie inmovilizado captura en un formato de microarrays. 4 , 14
Las gotitas, ellos mismos, se pueden formar en arreglos de discos en superficies planas, gotita llamada microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotitas en arreglos de discos permite que sean convenientemente indexadas, fácilmente monitoreado en el tiempo, individualmente dirigida y, si es necesario, obtenido. Microarrays de gota puede alcanzar una alta densidad de micro reactores con miles de elementos por chip ya sea libre o apoyado por las estructuras de los micropocillos. 18 , 19 , 20 , pueden ser formados por la deposición secuencial por robots de manejo de líquidos, observadores de inyección de tinta, en contacto con microarrayers21,22,23,24,25, 26 o se puede uno montar en superficies tales como superhydrophillic puntos con motivos sobre una superficie superhidrófobos. 27 , 28 , 29
Con estas consideraciones en mente, direccionable gotita Microarrays (ADMs) fueron diseñados para combinar la versatilidad, direccionamiento espacial y volúmenes reducidos de microarrays de gota con la sensibilidad de la microscopía TIRF de sola molécula a cuantitativamente medir la abundancia de la proteína. 5 ADMs permiten análisis de la célula formando un microarray de gotas que contienen las células sobre un microarray de anticuerpo, que luego es cubierto con aceite para evitar la evaporación. Los volúmenes de las gotas son discretos para evitar pérdida de muestra, que de lo contrario se lograría por la en-viruta valvulado en microfluídica de flujo continuo. 30 la cantidad absoluta de proteínas blanco de una sola célula es extremadamente pequeña; sin embargo, el reducido volumen de las gotas permite la relativamente alta concentración local a fin de que se detectan mediante un análisis de anticuerpos del emparedado – anticuerpo es inmovilizado en una región distinta, o de punto, sobre una superficie que capta proteínas que a su vez se une a un anticuerpo de detección fluorescente etiquetado presente en el volumen de la gota. Como un enfoque libre de etiqueta (es decir, proteína de objetivos no es necesario etiquetar directamente), ADMs son generalmente aplicables para el análisis de células a partir de fuentes primarias, tales como sangre procesada, es necesario bien aspirados y biopsias de tumor disociado, así como las células de cultura y los lisados.
Medir la variación en la abundancia de proteínas a través de una población celular es importante en la determinación de la heterogeneidad en la respuesta, por ejemplo, a una droga y ayudará en la provisión de información sobre las funciones celulares y vías, evaluación de subpoblaciones y su comportamiento, así como identificar eventos raros que lo contrario serían ser enmascarados por métodos a granel. Este protocolo describe cómo producir y utilizar gota direccionable microarrays para determinar cuantitativamente la abundancia de la transcripción factor p53 en células cancerosas humanas y puede ser utilizado para investigar el papel de p53 en respuesta a los fármacos quimioterapéuticos. La proteína Diana es determinada por la opción de captura y detección de anticuerpos y puede modificarse para incluir más o diferentes objetivos. Se proporcionan instrucciones para construir un aparato sencillo que incorpora una boquilla concéntrica de consumibles de laboratorio general al array manualmente 10 gotitas de nL con aceite. Se describe el proceso completo experimental por el que cada gota se carga entonces con una sola célula, que luego es lisada y la expresión de proteína determinada con la resolución sola molécula mediante microscopía TIRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Direccionable de gotita de Microarrays son un método sensible y extensible para determinar cuantitativamente el número de copia absoluta de proteína dentro de una sola célula.
Limitar el nivel de la Unión no específica (NSB) es fundamental en el protocolo para alcanzar hasta un límite de detección posible. Proteínas y otras especies bioquímicas no específicamente pueden obligar a un número de interfaces presentes dentro de las gotas, la superficie del cubreobjetos, el anticuerpo sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR había diseñado experimentos, desarrolló protocolos y análisis de datos. SC y PS realizan experimentos de tamaño celular. ASR y OC escribieron el manuscrito. Los autores desean agradece el apoyo del Prof. David R. Klug para proporcionar acceso al equipo. Los autores desean agradecer la Imperial College avanzado Hackspace para acceso a instalaciones de prototipado y fabricación.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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