Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma
Summary
Burada adresli damlacık microarrays (ADM’ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM’ler kapasitesini göstermek.
Abstract
Sık sık hücresel davranış ve hücresel yanıt nerede birçok hücre yanıtları birlikte zengin tek hücre davranış karmaşık bir nüfus içinde maskeleme ortalama bir sonucu olarak havuza nüfus düzeyinde analiz edilir. Tek hücre proteini algılama ve miktar teknolojileri son yıllarda kayda değer bir etki yapmış. Burada bir pratik ve esnek tek hücre Analizi platform adresli damlacık microarrays üzerinde tabanlı açıklayın. Bu çalışma nasıl hedef proteinler mutlak kopya sayısına tek hücre çözünürlük ile ölçülen açıklar. Tümör baskılayıcı p53 ile toplam kanser vakalarının bir sigara sağlıklı p53 ifade deseni sergileyen % 50’den fazla insan kanseri en sık mutasyona uğramış gen var. Protokolü ile tam ifade değişkenlik belirlemek için tek molekül kararlılık içinde olan tek insan kanser hücreleri izole edilmiştir ve p53 protein kopya sayısı ölçülen 10 nL damlacıkları oluşturmak için adımları açıklar. Yöntem ilgi herhangi bir hedef proteinler mutlak kopya sayısını belirlemek için birincil malzeme dahil olmak üzere herhangi bir hücre türüne uygulanabilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı bereket bir hedef proteinin hücre popülasyondaki özneleri, tek hücre çözünürlük varyasyon tespit etmektir. Tek hücre Analizi birçok geleneksel ensemble biyokimyasal yöntemlerle kullanılamaz avantaj sağlar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 öncelikle, tek hücre düzeyinde çalışan nüfusunun geleneksel ensemble biyokimyasal teknikleri ile oluşan sayı ortalaması alınarak kaybeden bir hücre zengin heterojenite yakalayabilirsiniz. Genellikle yapmak gibi çoğu iş-at biyokimyasal Yöntemler ile toplu, gerektiren, milyonlarca hücre bir sonucu elde etmek için çalışır. Tabii ki, tüm hücre popülasyonlarının değerlendirme sonuçlarını bağlı bir dizi faktöre, örneğin, heterojenite protein ifadesindeki nerede bazı önemli özellikleri protein bereket dağılımı özledim. Pratik bir bakış açısından, tek hücre teknikleri gerekli hassasiyeti onları çalışmaya bile daha duyarlı toplu teknikleri için yetersiz biyolojik malzeme miktarları ile çalışma yeteneğine sahip olun. Bu anahtar bir örnek gibi tümör hücreleri (CTCs) nerede kötü prognostik outlook olan hastalar için bile 10 CTCs bir tek 7.5 mL kan mevcut olabilecek daha az çizmek dolaşan nadir hücre tipleri çalışmadır. 6 burada tek hücre proteini ölçümleri antikor tabanlı tahlil petrol şapkalı damlacıkları istihdam bir antikor Mikroarray baskılı azaltılmış bir birim için gerçekleştirmek için gereken yöntemi mevcut.
Mikrosıvısal damlacık platformlarına yüksek işlem hacmi, damlacıkları ikinci ve yetenekli yalıtma ve hatta kültür, tek hücre başına binlerce bireysel damlacıkları biyokimyasal testleri geniş bir dizi gerçekleştirmek için elde edebilecektir. Damlacık tabanlı teknikleri de tek hücre analizi,7,8,9 ile hangi büyük ölçüde gücüyle destekli DropSeq1110 ve inDrop, dahil olmak üzere önemli son örnek için uygundur güçlendirme teknikleri. Malzeme sınırlı miktarda amplifikasyon hiçbir yöntem proteinler için yapmak ve tek hücre proteomik özellikle zorlu.
Damlacıkları birkaç yöntem tarafından analiz edilecek ve floresans mikroskobu yaygın olarak kullanılmıştır. Toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi gibi tek molekül teknikleri ile eşsiz sinyal-gürültü oranı görüntülenmeyecektir floresan molekülleri sağlar. 12 fani alan üstel çürümesi nedeniyle, TIRF iyi bir strateji karmaşık bir karışımı bir hedef molekül küçük miktarlarda saptamada yapma sadece fluorophores (sırasıyla 100nm) yüzeyine yüksek birbirine heyecanlı mısın. Zaman ve karmaşıklık sınırları tahlil ve TIRF doğal optik parça gücünü de yıkama adımları önlemek için yardımcı olur. Ancak, TIRF düzlemsel yüzeyler gerektirir ve bir düzlemsel yüzeyine hangi görüntü oluşumu damlacıkları akışı uygulanan TIRF mikroskobu örnekleri içerir. 13 bu amaçla, tek hücre proteomik teknikler kez mikrosıvısal çip çevresinde yüzey immobilize yakalama ajanlar bir Mikroarray biçimde tasarlayın. 4 , 14
Damlacıkları, kendilerini, düzlemsel yüzeylerde, sözde damlacık microarrays dizilerde oluşmuş. 15 , 16 , 17 dağınık şekilde organize damlacıkları dizilerden onlara uygun dizine, kolayca zaman içinde izlenen, ayrı ayrı ele alınması ve gerekirse, alındı sağlar. Damlacık microarrays yüksek yoğunluklu mikro-reaktörler müstakil veya microwell yapıları tarafından desteklenen elemanları küçük parça başına binlerce elde edebilirsiniz. 18 , 19 , 20 oluşturdular tarafından sıvı işleme robotlar, mürekkep püskürtmeli spotters, sıralı ifade tarafından microarrayers21,22,23,24,25, iletişim 26 ya da kendi kendine bir araya superhydrophillic gibi yüzeylerde lekeler desenli bir superhydrophobic yüzeye. 27 , 28 , 29
Bunu göz önünde bulundurarak, adresli damlacık Microarrays (ADM’ler) çok yönlülük, kayma adreslenebilirliği ve damlacık microarrays düşük hacimli teminatlarının tek molekül TIRF Mikroskopi için duyarlılık ile birleştirmek için tasarlanmıştır protein bereket ölçmek. 5 daha sonra buharlaşma önlemek için yağ ile kaplıdır bir antikor Mikroarray üzerinde tek hücreleri içeren bir damlacık Mikroarray oluşturan tek hücre Analizi ADM’ler etkinleştirin. Damlacıkları hacimleri üstünde-küçük parça içinde sürekli akışı Havacilik valving tarafından elde örnek kaybını önlemek için ayrı. 30 hedef protein tek bir hücreden mutlak miktarı son derece küçüktür; Ancak, damlacıkları azaltılmış hacmi için nispeten yüksek yerel yoğunlaşması sağlar bir sandviç antikor tahlil kullanarak algılanır – antikor ayrı bir bölgede ya da nokta, hangi sırayla bağlayan protein yakalar bir yüzey üzerinde immobilize umulur ki için bir fluorescently etiketli algılama antikor damlacık hacmindeki mevcut. Bir etiket içermeyen bir yaklaşım (yani protein hedefler doğrudan etiketli gerek yok), ADM’ler işlenmiş kan gibi birincil kaynakları hücrelerinden analiz için genellikle tabidir, iyi örnekleri ve Disosiye tümör biyopsi yanı sıra kültür hücrelerden gerekir ve onların lysates.
Buna karşılık, örneğin, heterojen bir ilaç belirlemede önemlidir varyasyon protein bolluk içinde bir hücre nüfus arasında ölçme ve hücresel işlevler ve yollar, altgrupları değerlendirme sağlamada yardımcı olacak ve onların Aksi takdirde toplu yöntemlerle maskeli nadir olayları tanımlayın yanı sıra davranış. Bu iletişim kuralı üretmek ve adresli damlacık microarrays kantitatif transkripsiyon faktörü p53 insan kanser hücrelerinin içinde bolluk belirlemek için nasıl kullanılacağını açıklar ve p53 kemoterapötik ilaçlara yanıt rolünü araştırmak için kullanılabilir olur. Hedef protein yakalama ve algılama antikorları seçimi ile belirlenir ve daha fazla veya farklı hedefleri içerecek şekilde değiştirilmiş. Genel Laboratuvar sarf malzemeleri el ile yağ ile şapkalı 10 nL damlacıkları dizi için gelen eş merkezli bir meme birleştiren bir basit aparatı oluşturmak için yönergeler sağlanmıştır. Her damlacık sonra sonra lysed tek bir hücre TIRF mikroskobu kullanılarak tek molekül çözümleme ile belirlenen protein ifade dolu olan sayede tam deneysel işlemi açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adresli damlacık Microarrays kantitatif tek bir hücrede bulunan protein mutlak kopya sayısını belirlemek için hassas ve genişletilebilir bir yöntemdir.
Non-spesifik bağlama düzeyini sınırlama (NSB) bir sınır tespiti mümkün olduğunca düşük olarak ulaşmak için iletişim kuralına önemlidir. Protein ve diğer biyokimyasal türler özellikle sigara bağlamak için arabirimler damlacıkları içinde mevcut bir dizi — coverslip yüzey, antikor nokta ve yağ/su arabirimi. Pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR deneyleri, protokolleri tasarlanıp geliştirildi veri analiz. SC ve PS hücre boyutu deneyleri yürüttü. ASR ve OC el yazması yazdı. Yazarlar minnetle Prof. David R. Klug destek ekipman erişim sağlamak için kabul etmek istiyorum. Yazarlar Imperial College gelişmiş Hackspace imalat ve prototip oluşturma özellikleri erişim için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. “One cell-one well”: A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip – Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA – Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
