Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å få subcellular protein lokalisering resultater på sebrafisk netthinnen av samkjøre super-oppløsning * lys og skanning elektronmikroskop bilder.
Vi presenterer en metode for å undersøke den subcellular protein lokaliseringen i larver sebrafisk netthinnen ved å kombinere super-oppløsning * lys og skanning elektronmikroskop. Sub Diffraksjon grense oppløsning evnene av super-oppløsning lys mikroskop kan forbedre nøyaktigheten av samsvarende data. Kort, 110 nanometer tykk cryo-partiene er overført til en silicon wafer og, etter immunofluorescence flekker, er fotografert av super-oppløsning * lys. Deretter er delene bevart i methylcellulose og platina skygget før imaging i en scanning elektron mikroskop (SEM). Bilder fra disse to mikroskopi modaliteter enkelt slås sammen med vev landemerker med åpen kildekode. Her beskriver vi tilpasset metoden for larver sebrafisk netthinnen. Denne metoden er imidlertid også gjelder for andre typer vev og organismer. Vi viser at utfyllende informasjon ved denne sammenhengen er løse uttrykk for mitokondrie proteiner i forhold til membraner og cristae av mitokondrier så vel som andre avdelinger av cellen.
Metoder for å bestemme den subcellular lokaliseringen av proteiner og deres forhold til forskjellige deler av cellen er viktige verktøy å forstå deres funksjonene og mulighetene for interaksjon. Super-oppløsning mikroskopi i kombinasjon med elektronmikroskop inneholder slik informasjon1. Bakken staten uttømming mikroskopi etterfulgt av personlige molekyl avkastning (GSDIM) er en super-oppløsning mikroskopi teknologi kompatibel med en rekke organiske og genetisk kodet fluorophores2 og oppnår en lateral oppløsning opptil 20 nm 3. inkorporering av metoder med høyere oppløsning enn standard Diffraksjon-begrenset mikroskopi forbedrer nøyaktigheten av korrelasjon4,5,6. For å oppnå best korrelasjon av protein uttrykk med et bestemt subcellular rom og redusere volumet av usikkerhet7 bruk av samme ultrathin inndeling for lys og elektronmikroskop anbefales. Blant de ulike snitting metodene, Tokuyasu cryo-delen protokollen krever ikke dehydrering eller harpiks innebygging og, i tillegg beholder antigenicity av mange epitoper og gir god vev ultrastructure8. Flere metoder har vist anvendelsen av disse delene i correlative lys og elektronmikroskop (CLEM)4,5,9,10.
Sebrafisk netthinnen er en verdifull modell visuell utvikling og menneskelig sykdom mekanismer gitt høyt konservert strukturen og funksjonen over virveldyr. I særdeleshet, netthinnen fotoreseptorer displayet samme arkitektur som pattedyr fotoreseptorer, med en basal synapse, en apico-basally langstrakt kjernen, klynger av mitokondrier i mer apikale indre segmentet og en ytre segmentet består av membran disker i mest apikale posisjon11. Protein lokaliseringen å mangfoldig mobilnettet seksjonene er bevart mellom sebrafisk og menneskelig, slik at etterforskningen av den biologiske menneskelig sykdom relevante proteiner12,13.
Her presenterer vi en protokoll for å forberede larver sebrafisk netthinnen prøver å løse lokaliseringen av mitokondrie ytre membran protein Tom20 ved correlative super-oppløsning lys og elektronmikroskop. Metoden er basert på å samle cryo-partiene på silisiumskiver, og hvordan kontrast topografiske opplysninger produsert etter et tynt lag av platinum. Disse trinnene er klart tekniske forbedringer inne pris av lette av bruk og reproduserbarhet tid eksperimenter. Vi har nylig demonstrerte anvendbarheten av metoden å oppdage kjernefysiske porene og mitokondrie proteiner i musen vev14.
Denne metoden kombinerer super løst protein lokalisering med kontekstinformasjon å bestemme den nøyaktige plasseringen av proteiner i en organelle. Her viser vi ferdigstillelse av å visualisere uttrykk for Tom20 i den ytre membranen av mitokondrier og plasseringen i forhold til andre organeller som kjerner eller ytre deler av photoreceptor i larver sebrafisk netthinnen.
Tokuyasu cryo-skjæring krever litt trening å erverve velbevarte deler. Dette er imidlertid en metode ansatt i mange laboratorier med suksess vist21. Overføring av deler til silisium kjeks er meget enkel og ingen spesielle hensyn er nødvendig. Bruk glyserol i tenkelig bufferen er et svært viktig skritt å unngå tørking av delene. For super-oppløsning bildebehandling oppnås de beste resultatene når kjeks er svært nær glass nederst Petriskål. Silikon stripene hjelpe opprettholde kjeks i denne posisjonen. Særskilt omsorg må tas under fjerning stripene for å unngå skade delene.
Tykkelsen av cryo-deler, rundt 100 nm, tynnere enn den optiske oppløsningen i Z-dimensjonen, forenkler i tillegg nøyaktigheten av denne correlative metoden super-oppløsning mikroskopi signalet kommer bare fra dette tynt lag og Scanning elektron mikroskop signal viser topografien prøven. Denne metoden kan også kombineres med flerfarget bildebehandling. Forsiktighet må imidlertid tas at prøven kan avbildes under samme forhold (f.eks tenkelig buffer) og kryss-snakk skulle være forhindret.
En begrensning av metoden er to dimensjonal tilnærming, siden bare et begrenset antall serielle deler (ca 3 til 7 per wafer) kan samles. Dermed være prosjektoppgaver volum analyse ikke ideelt. Det er imidlertid en metode som kan brukes til å oppdage protein uttrykk i alle typer vev av enkel skjæring i prøven. Vi gir en metode uten bruk av klassisk kontrast agenter som uranyl acetate eller bly citrate. Kontrasten av platina skygge gir meget informativ topografiske kontrast, men i noen tilfeller membraner er vanskelig å løse. Dette kan utgjøre problemer for prosjekter som trenger, for eksempel å bestemme uttrykk for proteiner i små blemmer.
Våre protokollen, basert på Tokuyasu cryo-seksjoner, bruker standard utstyr for å få correlative resultater fra super-oppløsning og scanning elektron mikroskop. Innsamling av deler på silisiumskiver og bruk av platinum for kontrast er enkle trinn for å gi stabilitet og reproduserbarhet til eksempel utarbeidelse.
The authors have nothing to disclose.
ION og RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione SCORE gir PZ00P3 142404/1 og PZ00P3 163979.
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
Sucrose | Merck | #1.07687 | |
Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
Glycine | Sigma | #G-7126 | |
Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
Wired loop "Perfect loop" | |||
Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc – 11415 | |
AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
SEM – Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
FIB-SEM – Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |