Användning av ett rekombinant Mosquito Densovirus som en gen leverans vektor för funktionell analys av gener i mygglarver
Summary
Vi rapporterar använder en konstgjord intronic små RNA uttryck strategi för att utveckla en icke-defekta rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveranssystem. Detaljerade anvisningar för konstruktion, förpackningar och kvantitativ analys av rAaeDV vektorer samt när det gäller larval infektion beskrivs.
Abstract
In vivo Mikroskop är den vanligaste gen överföring tekniken för att analysera funktionerna genen i enskilda myggor. Men denna metod kräver en mer tekniskt krävande operation och innebär komplicerade förfaranden, särskilt när de används i larver på grund av sin ringa storlek, relativt tunna och sköra nagelbanden och hög dödlighet, som begränsar dess tillämpning. Virala vektorer för gen leverans har däremot utvecklats för att övervinna extracellulära och intracellulära hinder. Dessa system har fördelarna med lätt manipulation, hög gen transduktion effektivitet, långsiktigt underhåll av genuttryck och förmågan att producera ihållande effekter i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) är mosquito-specifika, små enkelsträngat DNA virus som effektivt kan leverera utländska nukleinsyror i mygga celler; men orsakar utbyte eller införande av främmande gener att skapa rekombinanta virus vanligtvis en förlust av förpackning eller replikering förmågor, som är ett hinder för utvecklingen av dessa virus som leverans vektorer.
Häri, rapporterar vi använder en konstgjord intronic små-RNA uttryck strategi för att utveckla en icke-defekta rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveranssystem. Detaljerade förfaranden för konstruktion, förpackningar och kvantitativ analys av rAaeDV vektorer, samt larval infektion beskrivs.
Denna studie visar, för första gången möjligheten att utveckla en icke-defekta rekombinant MDV micro RNA (miRNA) uttryck systemet, och därmed ger ett kraftfullt verktyg för funktionell analys av gener i mygga och att upprätta en grund för den tillämpning av viral paratransgenesis för att styra myggor sjukdomar. Vi visat att Aedes albopictus 1st instar larver kan vara enkelt och effektivt smittad genom att införa viruset i vattenförekomsten av de larver som avel webbplats och att de utvecklade rAaeDVs kunde användas till överuttrycka eller slå ner den uttrycket av en specifik gen i larver, ger ett verktyg för funktionell analys av mygga gener.
Introduction
Moskitburen sjukdomar såsom malaria, denguefeber, zika feber och gula febern, är stora internationellt folkhälsoproblem som fortsätter att stå för en betydande del av den globala infektionssjukdomar börda1,2. Konventionella insekticider, som har använts i svar till vektorer, är en viktig del av hållbar integrerad mygga strategi för förebyggande av myggor sjukdomar. Sådana strategier har dock visat sig vara relativt ineffektiva eller oönskade på grund av den associera negativa miljöpåverkan samt utvecklingen av motstånd i mygga populationer3,4. Av dessa skäl finns det ett brådskande behov av alternativa metoder för mygga kontroll och användning av transgena metoder att producera sterila manliga myggor och frisläppandet av patogen-resistenta myggor har uppstått som lovande nya kontrollstrategier. För att utveckla effektiva nya kontrollmetoder, såsom säkra och effektiva metoder för in-vivo gen leverans, den omfattande analysen av mygga geners funktion krävs.
Direkta Mikroskop av plasmid DNA, dubbel stranded RNA (dsRNA) eller små störande RNA (siRNA) är vanligaste i vivo gen leveransmetod som myggor. Faktum är att produktionen av transgena stammar av myggor fortfarande förlitar sig på en process av embryo Mikroskop5,6,7. Mikroskop har dock flera begränsningar. Först, denna teknik är tekniskt krävande och komplicerade förfaranden tillämpas. Andra orsakar injektionen en fysiska förolämpning till embryo, larver, puppor och vuxen, vilket direkt påverkar lönsamheten för målorganismen. För det tredje är det svårt att immobilisera mygglarver för Mikroskop eftersom de flesta lever i en akvatiska habitat och besitter en egenskap som slingrande rörelse. Fjärde, storleken på 1st-2nd instar larver är 10 till 20 gånger mindre än 4th instar och äldre larver och nagelbanden den förstnämnda är mer känsliga. Dessa egenskaper gör det svårt att manipulera 1st-2nd instar larver jämfört med dem i äldre stadier. Kombinerat, bidrar dessa faktorer till en minskad efter injektion överlevnad för larver (cirka 5%) jämfört med vuxna8. Viral-baserade leverans system har utvecklats för att övervinna de associera extracellulära och intracellulära hinder. Dessa system har fördelarna med lätt manipulation, hög transduktion effektivitet, långsiktiga och stabila nivåer av uttryck och förmågan att producera ihållande effekter i vivo. Därför används gen leverans system utnyttja retrovirus, lentiviruses och adenoviruses har varit allmänt inmammalian cellinjer och modell arter. Sindbis virus uttryck systemet hade tidigare använts för att analysera funktionen genen i vuxen mygga; Förutom den biosäkerhet oro är injektionen dock fortfarande en nödvändig process för virusinfektion9. Även den muntliga leveransen genom att blötlägga larver i dsRNA lösningen har rapporterats tidigare som ett genomförbart leveransmetod, är det olämpliga för små RNA funktionen analys10. Så, effektiv viral leveransmetoder måste fortfarande utvecklas för myggor.
Mosquito densoviruses (MDVs) är en del av Densovirinae underfamiljen av Parvoviridae, och alla utom en faller inom släktet Brevidensovirus11. MDV virioner är icke höljeförsedda och består av ett enkelsträngat DNA (ssDNA)-genom och en ikosaedrisk kapsid (20 nm i diameter). Det virala genomet är cirka 4 kb i storlek och replikeras inom atomkärnor av värdceller. MDVs är relativt stabilt i miljön och visa ett smalt spektrum med hög specificitet för myggor. Dessa virus har potential att sprida och kvarstår naturligtvis i mygga populationer och kan invadera nästan alla organ och vävnader av dessa insekter, däribland midgut, Malpighian tubuli, fett kroppen, muskulatur, nervceller, och spottkörtlar12.
Intakt MDV genomen kan vara subcloned i plasmiden vektorer att producera plasmid-baserade smittsamma kloner; När dessa kloner levereras i mygga celler, det virala genomet utvinns från plasmiden vektorn och infektiösa viruspartiklar produceras. Eftersom MDV har en liten ssDNA genomet, infektiös kloner är enkelt uppbyggda och det virala genomet kan vara lättmanipulerade11,13. Dessa egenskaper gör MDV ett värdefullt medel för att pröva mygga biologi. Men eftersom nästan alla av den virala genomet sekvensen är viktigt för viral spridning, skapandet av rekombinanta virus genom att ersätta eller införande av främmande gener orsakar en förlust i viral förpackningar eller replikering förmågor, vilket skapar en hinder för utvecklingen av MDVs som gen leverans vektorer. Häri, rapporterar vi använder en konstgjord intronic små-RNA uttryck strategi för att utveckla ett icke-defekta rAaeDV i vivo RNA leveranssystem som har fördelarna med lätt plasmid konstruktion och underhåll av en funktionell virus som kan producera stabil och långsiktig uttryck i värdceller utan behov av vildtyp virus. Dessutom tillåter denna metod den lätt transduktion av larver.
Protokollen för de följande stegen beskrivs i denna studie: 1) utformningen av rAaeDVs kodning en intronic liten-RNA uttryck kassett, 2) produktion av rekombinant viruspartiklar med C6/36 förpackningar cellen fodrar, 3) kvantitativ analys av cellfria rAaeDV genomet kopiera siffror och 4) infektion av Ae. albopictus larver av direkt införande av virus i vatten kroppen larval livsmiljö. Sammantaget visade detta arbete att specifika små RNAs eller målgener kan i ökad utsträckning eller slogs ner i mygglarver dispensersystem utvecklade MDV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är viktigt att övervinna två av de viktigaste hindren som begränsar rAaeDV konstruktion. Först är produktionen av defekta rekombinanta virus. Det har rapporterats att MDV kan användas som en vektor att uttrycka korrekt storlek främmande gener, såsom scorpion insekt-specifika neurotoxins20 och proteinet GFP; men oavsett konstruktion strategin, när den ORFs av MDV infogas eller ersättas med exogena gener, virioner kan inte bilda självständigt såvida inte en helper plasmid är cotransfected för att tillha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner finansiellt stöd från nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2016YFC1200500 till Xiao-Guang Chen), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (81672054 och 81371846), Team forskningsprogrammet inom naturligt Science Foundation av Guangdong (2014A030312016), och vetenskapliga och tekniska programmet för Guangzhou (201508020263). Vi erkänner tacksamt Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) för vänligt att tillhandahålla de pUCA och p7NS1-GFP plasmidsna och kritiskt läsa detta manuskript.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
