Summary

Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

Published: October 06, 2017
doi:

Summary

Segnaliamo che utilizzando un’artificiale intronic piccolo RNA espressione strategia per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. È descritta una procedura dettagliata per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV anche per quanto riguarda l’infezione larvale.

Abstract

Microiniezione in vivo è la tecnica di trasferimento del gene più comunemente usati per analizzare la funzione genica nelle zanzare individuali. Tuttavia, questo metodo richiede una più tecnicamente impegnativa operazione e comporta procedure complicate, soprattutto quando viene utilizzato nelle larve a causa della loro piccola dimensione, cuticola relativamente sottile e fragile e alta mortalità, che limitano la sua applicazione. Al contrario, vettori virali per la consegna del gene sono stati sviluppati per superare barriere extracellulari ed intracellulari. Questi sistemi presentano i vantaggi di facile manipolazione, efficienza di trasduzione genica alta, manutenzione a lungo termine dell’espressione genica e la capacità di produrre gli effetti persistenti in vivo. Zanzara densoviruses (MDVs) sono specifici di zanzara, piccolo virus a DNA singolo filamento può trasportare efficacemente esteri acidi nucleici nelle cellule di zanzara; Tuttavia, la sostituzione o l’inserimento di geni estranei per creare virus ricombinante in genere comporta una perdita di capacità di imballaggio e/o replica, che è una barriera allo sviluppo di questi virus come vettori di consegna.

Qui, segnaliamo che usando una strategia artificiale intronic piccolo-RNA espressione per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. Sono descritte le procedure dettagliate per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV e per infezione larvale.

Questo studio dimostra, per la prima volta, la possibilità di sviluppare un non-difettosi ricombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema di espressione e quindi fornire un potente strumento per l’analisi funzionale dei geni nella zanzara stabilendo una base per la applicazione di paratransgenesis virale per controllare le malattie trasmesse dalle zanzare. Abbiamo dimostrato che le larve di Aedes albopictus 1st instar potrebbero essere facilmente ed efficacemente infettate introducendo il virus nel corpo idrico delle larve sito di allevamento e che il rAaeDVs sviluppati potrebbero essere utilizzati per overexpress o abbattere il espressione di un gene target specifico nelle larve, fornendo uno strumento per l’analisi funzionale di zanzara geni.

Introduction

Zanzara di malattie come la malaria, la febbre dengue, febbre zika e febbre gialla, sono problemi di salute pubblica internazionale che continuano a rappresentare una frazione significativa della malattia infettiva globale onere1,2. Insetticidi convenzionali, che sono stati utilizzati in risposta a vettori, sono una componente importante della strategia di controllo della zanzara integrato sostenibile per la prevenzione delle malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, tali strategie hanno dimostrato di essere relativamente inefficace o indesiderabili dovuto gli impatti ambientali negativi associati così come l’evoluzione della resistenza nella zanzara popolazioni3,4. Per questi motivi, c’è un urgente bisogno di metodi alternativi di zanzara controllo e l’uso di metodi transgenici per produrre zanzare maschile sterile e il rilascio di zanzare patogeno-resistente sono sorti come promettenti nuove strategie di controllo. Per sviluppare un controllo efficace nuovi metodi, come approcci sicuri ed efficaci per genico in vivo , l’analisi completa di funzione del gene di zanzara è richiesto.

Microiniezione diretta del plasmide DNA, doppio incagliato RNA (dsRNA) o short interfering RNA (siRNA) è il più comunemente usato in vivo gene consegna metodo nelle zanzare. Infatti, la produzione di ceppi transgenici di zanzare ancora contare su un processo di embrione microiniezione5,6,7. Tuttavia, la microiniezione presenta diverse limitazioni. In primo luogo, questa tecnica è tecnicamente impegnativo e comporta procedure complicate. In secondo luogo, iniezione provoca un insulto fisico per l’embrione, larve, pupe e adulto, che colpisce direttamente la vitalità dell’organismo bersaglio. In terzo luogo, è difficile immobilizzare le larve di zanzara per il microinjection perché la maggior parte vivono in un habitat acquatico e possiedono una caratteristica guizzante di movimento. In quarto luogo, la dimensione di 1st-2nd instar larve è 10 – 20 volte più piccola di quella di 4th instar e larve di età superiore e le cuticole dell’ex sono più delicate. Queste caratteristiche lo rendono difficile da manipolare 1st-2nd instar larve rispetto a quelli nelle fasi precedenti. Combinati, questi fattori contribuiscono a un tasso di sopravvivenza riduttore post-iniezione per le larve (5% circa) rispetto a adulti8. Sistemi di consegna basati su virale sono stati sviluppati per superare le barriere extracellulari ed intracellulari associate. Questi sistemi presentano i vantaggi di facile manipolazione, efficienza di trasduzione alta, robusti e a lungo termine i livelli di espressione e la capacità di produrre gli effetti persistenti in vivo. Di conseguenza, gene consegna sistemi che utilizzano retrovirus, lentivirus e gli adenovirus sono stati ampiamente usato linee cellulari inmammalian e specie modello. Il sistema di espressione virale Sindbis era stato precedentemente utilizzato per analizzare la funzione genica nella zanzara adulta; oltre le preoccupazioni di sicurezza biologica, tuttavia, l’iniezione è ancora un processo necessario per infezione virale9. Anche se, la consegna orale impregnando le larve nella soluzione dsRNA è stata segnalata precedentemente come un metodo di consegna fattibile, è inadatto per piccoli RNA funzione analisi10. Così, metodi di consegna virale efficace ancora devono essere sviluppati per le zanzare.

Zanzara densoviruses (MDVs) fanno parte della sottofamiglia Densovirinae dei Parvoviridaee tutti, ma una caduta all’interno del genere Brevidensovirus11. I virions MDV sono senza involucro e sono costituiti da un singola elica (ssDNA) genoma e un capside icosaedrica (20 nm di diametro). Il genoma virale è di circa 4 kb e viene replicato all’interno dei nuclei delle cellule dell’ospite. MDVs sono relativamente stabili nell’ambiente e mostrare una gamma stretta host con alta specificità per le zanzare. Questi virus hanno il potenziale per diffondere e mantenere naturalmente nelle popolazioni di zanzare e possono invadere quasi tutti gli organi e tessuti di questi insetti, tra cui del midgut, tubuli malpighiani, corpo grasso, muscolatura, neuroni e ghiandole salivarie12.

Genomi MDV intatti possono subclonati in vettori plasmidici per produrre cloni infettivi basati su plasmide; Quando questi cloni sono trasportati nelle cellule della zanzara, il genoma virale viene estratta dal vettore plasmidico e particelle virali infettive sono prodotte. Perché MDV ha un genoma di piccole ssDNA, cloni infettivi sono facilmente costruiti e il genoma virale può essere facilmente manipolabile11,13. Queste caratteristiche rendono MDV un agente importante per l’esame di biologia della zanzara. Tuttavia, poiché quasi tutti della sequenza del genoma virale è essenziale per la proliferazione virale, la creazione di virus ricombinante attraverso la sostituzione o l’inserimento di geni estranei comporta una perdita nella capacità di imballaggio e/o replica virale, che crea un barriera per lo sviluppo di MDVs come vettori di consegna del gene. Qui, segnaliamo che usando una strategia artificiale intronic piccolo-RNA espressione per sviluppare un rAaeDV non difettosi in vivo RNA delivery system che ha i vantaggi della costruzione del plasmide facile e la manutenzione di un virus funzionale che può produrre stabile e a lungo termine l’espressione in cellule di host senza la necessità di virus wild-type. Inoltre, questo metodo consente la facile trasduzione delle larve.

In questo studio vengono descritti i protocolli per le fasi successive: linea 1) progetto di rAaeDVs codifica una cassetta di espressione di piccolo-RNA intronic, 2) produzione di particelle di virus ricombinante mediante la cella di imballaggio C6/36, 3) analisi quantitativa di cella-free rAaeDV genoma copiare numeri e 4) infezione delle larve di Ae. albopictus per introduzione diretta del virus nel corpo dell’acqua dell’habitat larvale. Nel complesso, questo lavoro ha dimostrato che piccole molecole di RNA specifici o geni bersaglio possono essere iperespresso o abbattuti in larve di zanzara utilizzando il sistema di consegna MDV sviluppato.

Protocol

tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico della Southern University Medical. 1. progettare un introne artificiale Nota: introne artificiale utilizzato in questo lavoro è 65 bp in lunghezza e la sequenza è 5 ' – GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG – 3 '. Posto Hpa ho restrizione del sito su entrambe le estremità dell’introne artificiale così quel Hpa ho digestione può rilasciare l’…

Representative Results

Strategie per la costruzione di rAaeDVUn vettore di rAaeDV difettoso è stato generato per esprimere il gene DsRed in larve di zanzara. Il plasmide risultante conteneva una videocassetta di proteina di fusione NS1-DsRed con la proteina VP eliminata (Figura 1A). rAaeDV plasmidi contenenti costrutti di espressione di miRNA, Mahdi, shRNA e spugna di miRNA sono stati progettati (mostrato in Figura 1</stro…

Discussion

È importante superare due dei principali ostacoli che limitano la costruzione rAaeDV. Il primo è la produzione di virus ricombinanti difettoso. È stato riferito che MDV può essere utilizzato come un vettore di esprimere in modo appropriato dimensioni geni estranei, come Scorpione insetto specifico neurotoxins20 e la proteina GFP; Tuttavia, indipendentemente dalla strategia di costruzione, una volta ORFs di MDV sono inseriti o sostituiti con geni esogeni, virioni non possono formarsi in modo indipendente a meno che un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono sostegno finanziario nazionale chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2016YFC1200500 a Chen Xiao Guang), National Foundation Natural Science of China (81672054 e 81371846), il programma di Team di ricerca del naturale La ricerca scientifica di Guangdong (2014A030312016) e il programma scientifico e tecnologico di Guangzhou (201508020263). Noi riconosciamo con gratitudine il Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) per gentilmente fornire i plasmidi pUCA e p7NS1-GFP e per la lettura critica di questo manoscritto.

Materials

Centrifuge machine Thermo Scientific 75004260
Centrifuge System Beckman Coulter 363118
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit Omega Biotech D6904
Purified Agar OXOID LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) Thermo Scientific EF0651
FastDigest HpaI Thermo Scientific FD1034
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL) Thermo Scientific EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell Beijing Transgen Biotech CD521-01
Ampicillin  Beijing Tiangen Biotech RT501
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco, Life Technologies  21875109
Fetal Bovine Serum( Australia Origin) Gibco, Life Technologies 10099141
penicillin/streptomycin Gibco, Life Technologies 15070063
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent  Invitrogen,Life Technologies 11668019
Proteinase K Promega MC5008
DNase I (RNase-free)  Invitrogen,Life Technologies AM2222
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Beijing Tiangen Biotech FP205

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Liu, P., Xu, J., Dong, Y., Chen, X., Gu, J. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (128), e56121, doi:10.3791/56121 (2017).

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