استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت
Summary
يوفر هذا البروتوكول تعليمات لعينات فيروس تلطيخ السلبية التي يمكن استخدامها بسهولة في بسل-2، -3، أو -4 المختبرات. ويشمل استخدام كبسولة المعالجة المبتكرة، الذي يحمي شبكة المجهر الإلكتروني انتقال ويوفر للمستخدم التعامل أسهل في البيئات أكثر اضطرابا ضمن بيوكنتينمنت.
Abstract
يستخدم انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) لمراقبة البنية التحتية للفيروسات ومسببات الأمراض الميكروبية الأخرى مع قرار نانومتر. معظم المواد البيولوجية لا تحتوي على عناصر كثيفة قادرة على تشتت الإلكترونات لخلق صورة؛ وبالتالي، وصمة عار السلبية، الذي يضع أملاح المعادن الثقيلة الكثيفة حول العينة، مطلوب. من أجل تصور الفيروسات في تعليق تحت تيم يجب تطبيقها على شبكات صغيرة المغلفة مع سطح شفاف فقط نانومتر سميكة. ونظرا لصغر حجمها وهشاشتها، يصعب التعامل مع هذه الشبكات وتتحرك بسهولة بواسطة التيارات الهوائية. يتم تلف السطح الرقيق بسهولة، وترك العينة صعبة أو مستحيلة للصورة. يجب التعامل مع الفيروسات المعدية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك) وبعضها يتطلب بيئة مختبرية حيوية. تلوث الفيروسات في مستويات السلامة الحيوية (بسل) -3 و -4 يشكل تحديا خاصا لأن هذه البيئات أكثر اضطرابا والفنيين مطلوب to ارتداء معدات الوقاية الشخصية (ب)، مما يقلل من البراعة.
في هذه الدراسة، قمنا بتقييم جهاز جديد للمساعدة في الفيروسات تلطيخ السلبية في بيوكنتينمنت. الجهاز هو كبسولة التي تعمل بمثابة طرف ماصة المتخصصة. مرة واحدة يتم تحميل شبكات في كبسولة، المستخدم ببساطة ينضح الكواشف في كبسولة لتسليم الفيروس والبقع إلى شبكة مغلفة، وبالتالي القضاء على التعامل مع المستخدم من الشبكات. على الرغم من أن هذه التقنية تم تصميمها خصيصا للاستخدام في بسل-3 أو -4 بيوكنتينمنت، فإنه يمكن تخفيف إعداد العينات في أي بيئة المختبر من خلال تمكين السهل تلطيخ السلبية من الفيروس. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة نفسها لإعداد عينات تيم الملون السلبي من الجسيمات النانوية، والجزيئات الكبيرة وعينات مماثلة.
Introduction
انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) هو أداة فعالة لعرض التشكل والبنية التحتية من العينات البيولوجية التي هي صغيرة جدا أن ينظر إليها مع المجهر الضوئي التقليدي 1 ، 2 ، 3 ، 4 . تيمس تبادل لاطلاق النار الإلكترونات من خلال عينة رقيقة جدا تنتج صورة عالية الدقة والإلكترونات لديها طول موجي أقصر بكثير من الضوء. المناطق من العينة التي ثني أو منع الإلكترونات تظهر مظلمة، في حين أن المناطق التي الإلكترون لوسنت تظهر بيضاء.
عدم وجود مادة كثيفة الإلكترون يجعل من الصعب فيروسات لعرض تحت تيم لأنها لا يمكن مبعثر الإلكترونات. تلطيخ السلبية هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لخلق التباين وعرض الفيروسات مع تيم. وقد اقترح أول إجراء سلبي تلطيخ من قبل برينر وهورن في عام 1959، استنادا إلى تجربة حيث هول (1955) وهكسلي (1957) أوسرفي ظهور الهياكل البيولوجية في النقيض العكسي عندما مغمورة في مادة كثيفة الإلكترون 5 . وقد ظلت عملية التلطيخ السلبي دون تغيير تقريبا خلال نصف القرن الماضي. تلطيخ سلبي ينطوي لفترة وجيزة تطبيق محلول ملح المعادن الثقيلة لعينة على شبكة تيم في محاولة لإحاطة الفيروس مع مادة كثيفة دون تسلل الفيروس 6 . هذا يخلق الحدود المظلمة ويكشف عن شكل الجسيمات 5 . تستخدم هذه الدراسة اثنين من الكواشف لالتلطيخ السلبي، خلات اليورانيل (وا) وحمض البوتاسيوم فوسفهوتنغستيك (بتا). كل من هذه البقع تستخدم عادة لصبغة سلبية العينات البيولوجية الصغيرة، مثل الفيروسات، المجمعات البروتين، والجسيمات النانوية 7 ، 8 ، 9 .
تقنية تلطيخ السلبية التقليدية هي دليل قطرة سلبية تلطيخ التكنولوجيانيك 7 . هذا الأسلوب يتطلب معالجة دقيقة من الصغيرة، والهياكل تيم الهشة مع ملقط لتطبيق كميات صغيرة من عينة الفيروس، وصمة عار، ويشطف. بروتوكول إعداد نموذجي ينطوي على تطبيق قطرة من تعليق عينة على سطح شبكة تيم المغلفة فيلم ( الشكل 1A ). بعد تعلق العينة على سطح الفيلم، يتم شطف الشبكة لإزالة الفيروسات غير الملتصقة وملطخة إما وا أو منطقة التجارة التفضيلية لبضع ثوان إلى دقيقة، اعتمادا على نوع العينة. السائل الزائد هو الأشرار بعيدا عن الشبكة عن طريق لمس قطعة من ورقة الترشيح على حافة الشبكة.
يتطلب أسلوب قطرة اليدوي أن يتم كل شبكة بشكل فردي. إذا لم يتم التعامل معها بعناية، يتم ثقب شبكات تيم المغلفة بسهولة، عازمة، أو ملوثة. معالجة عينات متعددة يمكن أن يؤدي إلى صعوبات في تتبع الشبكات وضمان تلطيخ متسقة لكل عينة. هذا الإجراء تلطيخ دليل أكثر من ذلك بكثير د(بسل) -3 و -4 مختبرات احتواء حيوي، وذلك بسبب معدات الوقاية الشخصية المطلوبة (ب) المطلوبة لهذه البيئات. معدات الوقاية الشخصية مرهقة وبيئة الاحتواء البيولوجي هو أكثر اضطرابا بكثير مقارنة مع مختبر منتظم. ويطلب من العاملين في مختبرات الاحتواء البيولوجي بسل-3 ارتداء زوجين من القفازات والعمل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك). هذه الطبقة المزدوجة من القفازات تقلل من حساسية اللمس وتقيد حركة المحركات الدقيقة. تدفق الهواء من بسك الذي يحمي المستخدم ويساعد على منع تلوث العينة يمكن أن يسبب العينات والبقع لتجف بسرعة كبيرة مما يؤثر على جودة وصمة عار. تدفق الهواء المضطرب قوي في بسك يمكن أيضا ضربة بسرعة بعيدا الشبكة التي ليست مضمونة بشكل جيد. في مختبرات الاحتواء البيولوجي بسل-4، هناك متطلبات إضافية للسلامة. ويطلب من الموظفين ارتداء بدلة ضغط إيجابية، مما يزيد من تقييد الحركة المادية والقدرة على رؤية واضحة والتلاعبصفح الشبكات. فني يعمل في بسل-4 أيضا يرتدي على الأقل 2 أزواج من القفازات، مع الزوج الخارجي كونه قفاز سميك مما يقلل كثيرا من البراعة والإحساس اللمسي. وأخيرا، فإن ملقط تستخدم للتعامل مع شبكات تيم حادة، مما يشكل خطرا على فني نظرا لقدرتها على ثقب القفازات. مع كبسولات تحتوي على شبكات، ملقط ليست ضرورية، وبالتالي توفير بديل آمن، ملقط خالية لمعالجة الشبكات في بيوكنتينمنت. وأخيرا، فإن الكبسولات توفر أيضا وسيلة فعالة لتخزين الشبكات أثناء المعالجة، والتطهير بخار الأوزميوم، وأثناء التخزين. وبالتالي الحفاظ على الشبكات المنظمة وآمنة من التلف.
في هذا التقرير، ونحن نقدم طريقة جديدة لشبكات تل تلطيخ السلبية في مختبرات الاحياء البيولوجية التي تستخدم كبسولات مبريب / ز، جهاز يستند إلى كبسولة لمعالجة الشبكة وتلطيخ 10 ، 11 ، 12 . كبسولة أكوموتعديل اثنين من شبكات تيم، ويقلل من التعامل المباشر، ويقلل من احتمال تلف الشبكة. الكبسولة تعلق مباشرة إلى ماصة واحدة أو متعددة القنوات بنفس الطريقة كما غيض ماصة، والسماح لتطبيق السوائل المختلفة للشبكات الواردة في. وهذا يتيح إعداد في وقت واحد من عينات متعددة مع شبكات مكررة ( الشكل 1B ). إلى وصمة عار سلبية مع كبسولات يتم استنشق عينة الفيروس في كبسولة وعقد لمدة 10 دقيقة للسماح للفيروسات امتزاز على أسطح الشبكة. ثم يتم غسل الشبكات مع الفيروس كثف مع منزوع الأيونات (دي) المياه وملطخة إما وا أو منطقة التجارة التفضيلية لبضع ثوان إلى 1 دقيقة. تستخدم هذه العملية نفس الخطوات بروتوكول والكواشف كطريقة قطرات اليدوي. والفرق هو أن كل عمل يحدث داخل الكبسولة مع عدم وجود مناولة المادية للشبكات. ( أرقام 1C ، 1D ).
وكان الغرض من هذه الدراسة لتقييم كبسولات كماطريقة جديدة للتلطيخ السلبي لعينات الفيروسات في بيئات الاحتواء البيولوجي. كما بحثت هذه الدراسة نوعية الصور تيم المنتجة من اثنين من إجراءات تعطيل الفيروس المختلفة: 1) تعطيل السريع، مع 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد، و 2) 24 ساعة تعطيل مع 2٪ غلوتارالدهيد. وقد أجريت كل من هذه باستخدام كبسولات. وأخيرا، قمنا بتقييم اثنين من البقع السلبية المستخدمة عادة، وا و بتا، لاستخدامها في الكبسولة. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
تلطيخ السلبية هي تقنية تيم قيمة لتقييم وتحجيم الفيروسات والمجمعات البروتين والجسيمات النانوية. وقد تم إعداد قطرات من هذه العينات عن طريق التحرك اليدوي للشبكات من كاشف إلى البقع السلبية البروتوكول الكلاسيكي لأكثر من نصف قرن. إنها عملية بسيطة، ولكنها تتطلب الخبرة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعرب عن شكرنا للدكتور جون كارا وروينا شكمان على تقديمه إيبولا نانو-فلبس المنقى والدكتور راجيني مدهساني لتوفير فيروس تشيكونغونيا والدكتور تشارلز (جيسون) لإيصال فئران الفئران المختبرية التي تعبر عن البروتينات السكرية لفيروس إيبولافيروس. نود أيضا أن نشكر ماج كارل سوفلر على تسهيل برنامج التدريب الصيفي (سيب) وبرنامج التلمذة الصناعية والهندسية (سيب) والدكتورة كاثرين فيلهلمسن للتدريب على السلامة في المختبر.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
