Biocontainment के भीतर वायरल नमूने के नकारात्मक धुंधले के लिए कैप्सूल का उपयोग
Summary
यह प्रोटोकॉल नकारात्मक धुंधला वायरस नमूने के लिए निर्देश प्रदान करता है जो आसानी से बीएसएल -2, -3 या 4 प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसमें एक अभिनव प्रसंस्करण कैप्सूल का उपयोग शामिल है, जो ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड की रक्षा करता है और उपयोगकर्ता को बैकोकंटनमेंट के भीतर और अधिक अशांत वातावरण में आसान संचालन प्रदान करता है।
Abstract
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग नैनोमीटर संकल्प के साथ वायरस और अन्य माइक्रोबियल रोगजनकों के अत्याधुनिक निरीक्षण के लिए किया जाता है। अधिकांश जैविक सामग्री में घने तत्व शामिल नहीं होते हैं जो एक छवि बनाने के लिए बिखरने वाले इलेक्ट्रॉनों में सक्षम होते हैं; इसलिए, एक नकारात्मक दाग, जो नमूना के आसपास घने भारी धातु के लवण की आवश्यकता है, आवश्यक है। मंदिर के तहत निलंबन में वायरस की कल्पना करने के लिए उन्हें छोटे से ग्रिड पर लागू किया जाना चाहिए जो पारदर्शी सतह से नैनोमीटर मोटी होती है। उनके छोटे आकार और नाजुकता के कारण, इन ग्रिड को संभाल करने में मुश्किल होती है और आसानी से हवा में धाराओं से चले जाते हैं। पतली सतह आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती है, छवि को नमूना मुश्किल या असंभव छोड़कर। संक्रमित वायरस को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में संभाला जाना चाहिए और कुछ को एक बायोकेंटिंमेंट लैबोरेटरी पर्यावरण की आवश्यकता होती है। जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) -3 और -4 में स्टीनिंग वायरस विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इन वातावरण में अधिक अशांति है और तकनीशियनों को आवश्यक हैव्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें, जो निपुणता कम हो जाती है।
इस अध्ययन में, हमने बायोकंटंमेंट में नकारात्मक धुंधला वायरस में सहायता के लिए एक नया उपकरण का मूल्यांकन किया। डिवाइस एक कैप्सूल है जो विशेष विंदुक टिप के रूप में काम करता है एक बार ग्रिड कैप्सूल में लोड हो जाते हैं, तो उपयोगकर्ता बस एस्पिरस को कैप्सूल में अभिकर्मित करता है जिससे कि वे एन्कपस्यूटेड ग्रिड को वायरस और दाग पहुंचाते हैं, जिससे उपयोगकर्ता ग्रिड को नियंत्रित कर सकते हैं। यद्यपि यह तकनीक विशेष रूप से बीएसएल -3 या -4 बायोकंटैनेमेंट में उपयोग के लिए तैयार की गई थी, लेकिन यह वायरस के आसान नकारात्मक धुंधला को सक्षम करके किसी भी प्रयोगशाला के वातावरण में नमूना तैयार करने को कम कर सकता है। नैनोकणों, अणुओं और इसी प्रकार के नमूनों के नकारात्मक दाग वाले मंदिर के नमूने तैयार करने के लिए इसी विधि को भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप 1 , 2 , 3 , 4 के साथ देखा जाना बहुत छोटा है कि जैविक नमूनों की आकृति विज्ञान और बुनियादी सुविधा को देखने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। टीईएम इलेक्ट्रॉनों को प्रकाश की तुलना में बहुत कम तरंगदैर्ध्य के रूप में एक उच्च संकल्प छवि उत्पादन एक बहुत पतली नमूने के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों को गोली मार। इलेक्ट्रॉनों के झुकाव या ब्लॉक करने वाले नमूने के क्षेत्र में अंधेरे दिखाई देते हैं, जबकि इलेक्ट्रान चमकदार क्षेत्रों में सफेद दिखाई देते हैं।
इलेक्ट्रॉन घने पदार्थ का अभाव वायरस को एक मंदिर के नीचे देखने में मुश्किल होता है क्योंकि वे इलेक्ट्रॉनों को तितर बितर नहीं कर सकते। नकारात्मक धुंधला हो जाना सबसे सामान्य तरीका है जो इसके विपरीत बनाने और एक मंदिर के साथ वायरस को देखने के लिए उपयोग किया जाता है। पहली नकारात्मक धुंधला प्रक्रिया 1 9 5 9 में ब्रेनर और हॉर्न द्वारा प्रस्तावित की गई थी, उस प्रयोग के आधार पर जहां हॉल (1 9 55) और हक्सले (1 9 57) पर्यवेक्षकएक इलेक्ट्रान-घने पदार्थ 5 में विसर्जित होने के बाद इसके विपरीत में जैविक संरचनाओं की उपस्थिति ved पिछली आधी शताब्दी में नकारात्मक धुंधला होने की प्रक्रिया लगभग अपरिवर्तित रही है। नकारात्मक धुंधला हो जाना, वायरस 6 घुसपैठ के बिना घने सामग्री के साथ वायरस को घेरने के प्रयास में एक मंदिर के ग्रिड पर नमूने के लिए एक भारी धातु के नमक समाधान को संक्षेप में शामिल करता है यह एक अंधेरे सीमा बनाता है और कण के आकार का पता चलता है 5 । यह अध्ययन नकारात्मक अभिप्राय, यूरैनल एसीटेट (यूए) और पोटेशियम फॉस्फोटोंग्स्टिक एसिड (पीटीए) के लिए दो अभिकर्मकों का उपयोग करता है। इन दोनों दाग सामान्यतः छोटे जैविक नमूने, जैसे कि वायरस, प्रोटीन परिसरों, और नैनोकणिक 7 , 8 , 9 को दागने के लिए इस्तेमाल किया जाता है।
पारंपरिक नकारात्मक धुंधला तकनीक मैनुअल छोटी बूंद नकारात्मक धुंधला तकनीक है7 नि 7 इस पद्धति के लिए संदंश के साथ छोटे, नाजुक मंदिर ग्रिड की सटीक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जिसमें वायरस के नमूने, दाग, और राइन्स की छोटी मात्रा को लागू किया जाता है। ठेठ तैयारी प्रोटोकॉल में फिल्म-लेपित होम ग्रिड ( चित्रा 1 ए ) की सतह पर नमूना निलंबन के एक छोटी बूंद को लागू करना शामिल है। फिल्म की सतह पर नमूना लगाए जाने के बाद, नमूना के प्रकार के आधार पर गैर-पक्षपाती वायरस को हटाने के लिए ग्रिड को धोया जाता है और कुछ मिनट से यूए या पीटीए के साथ दाग किया जाता है। ग्रिड के किनारे तक फिल्टर पेपर के एक टुकड़े को छूकर ग्रिड से अतिरिक्त तरल दूर होती है।
मैनुअल छोटी बूंद विधि की आवश्यकता है कि प्रत्येक ग्रिड को व्यक्तिगत रूप से बनाया जाए यदि सावधानीपूर्वक संभाला नहीं, लेपित तापमान ग्रिड आसानी से पक्का हो जाते हैं, मुड़े या दूषित होते हैं कई नमूने संसाधित करने से ग्रिड्स पर नज़र रखने में कठिनाइयों का सामना हो सकता है और प्रत्येक नमूने के लिए लगातार धुंधला हो जाना सुनिश्चित हो सकता है। यह मैनुअल स्टैनिंग प्रक्रिया बहुत अधिक हैइन वातावरणों के लिए जरूरी निजी सुरक्षा उपकरणों (पीपीई) की वजह से बायोसाफेटी स्तर (बीएसएल) -3 और -4 बायोसंटेंटनिंग प्रयोगशालाओं में आयोजित होने पर, पीपीई बोझिल है और एक नियमित प्रयोगशाला की तुलना में बायोकेंटनमेंट वातावरण बहुत अधिक अशांत है। बीएसएल -3 बायोसंटेंटन लैबोरेटरीज में काम करने वाले कार्मिकों को 2 जोड़ी के दस्ताने पहनने और जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में काम करना पड़ता है। दस्ताने की यह डबल परत स्पर्श संवेदनशीलता को कम करती है और ठीक मोटर आंदोलन को नियंत्रित करती है बीएससी के वायु प्रवाह जो उपयोगकर्ता की सुरक्षा करता है और नमूना प्रदूषण को रोकने में मदद करता है, नमूने और दाग को बहुत जल्दी से सूखने के कारण दाग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। बीएससी में मजबूत अशांत एयरफ्लो भी जल्दी से ग्रिड को दूर कर सकता है जो कि अच्छी तरह सुरक्षित नहीं है। बीएसएल -4 बायोकेंटेंटन प्रयोगशालाओं में, अतिरिक्त सुरक्षा आवश्यकताएं हैं कार्मिकों के लिए एक सकारात्मक दबाव सूट पहनना आवश्यक है, जो आगे शारीरिक आंदोलन और स्पष्ट रूप से देखने और माने माने की क्षमता को प्रतिबंधित करता हैUlate ग्रिड बीएसएल -4 में काम करने वाली तकनीशियन भी कम से कम 2 जोड़ी के दस्ताने पहनती हैं, साथ ही बाहरी जोड़ी एक मोटी दस्ताने है जो कि निपुणता और टेंटाइल सनसनी को कम करती है। अंत में, तेम ग्रिड को संभालने के लिए प्रयुक्त संदंश तेज होते हैं, जिससे पेंचकर दस्ताने की उनकी क्षमता के कारण तकनीशियन के लिए जोखिम पैदा होता है। ग्रिड वाले कैप्सूल के साथ, संदंश आवश्यक नहीं होते हैं, इस प्रकार बायोकंटंमेंट में ग्रिड को हेरफेर करने के लिए एक सुरक्षित, संदंश-मुक्त विकल्प प्रदान करते हैं। अंत में, कैप्सूल प्रोसेसिंग, ओस्मिमियम वाष्प परिशोधन और भंडारण के दौरान ग्रिड को स्टोर करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है; जिससे ग्रिड को व्यवस्थित और क्षति से सुरक्षित रखा जाता है।
इस रिपोर्ट में, हम जीपीआरपी / जी कैप्सूल, ग्रिड हैंडलिंग और 10 , 11 , 12 धुंधला के लिए एक कैप्सूल-आधारित डिवाइस का इस्तेमाल करने वाले बायोसेंटेंटिंग प्रयोगशालाओं में नकारात्मक धुंधला मंदिर ग्रिड के लिए एक नई विधि पेश करते हैं। कैप्सूल साथदो मंदिर ग्रिड को संशोधित करता है, सीधी हैंडलिंग को कम करता है, और ग्रिड क्षति की संभावना कम करता है। कैप्सूल सीधे एक एकल या मल्टीचैनल पिपेट को एक विंदुक टिप के रूप में जोड़ता है, जिसमें विभिन्न तरल पदार्थों के आवेदन को ग्रिड में शामिल किया जा सकता है। इससे डुप्लिकेट ग्रिड ( चित्रा 1 बी ) के साथ कई नमूने की एक साथ तैयारी सक्षम हो जाती है। कैप्सूल के साथ नकारात्मक दाग करने के लिए वायरस का नमूना कैप्सूल में महत्वाकांक्षी है और 10 मिनट के लिए रखा जाता है ताकि वायरस को ग्रिड सतहों पर सोखना पड़े। Adsorbed वायरस के साथ ग्रिड बाद में विआयनीकृत (डीआई) पानी से धोया जाता है और कुछ सेकेंड से 1 मिनट तक यूए या पीटीए के साथ दाग जाता है। यह प्रक्रिया मैनुअल छोटी बूंद विधि के रूप में एक ही प्रोटोकॉल चरणों और अभिकर्मकों का उपयोग करती है; यह अंतर यह है कि सभी काम कैप्सूल के अंदर होता है, जिसमें ग्रिड के कोई भौतिक प्रबंधन नहीं होता है। ( आंकड़े 1 सी , 1 डी )
इस अध्ययन का उद्देश्य कैप्सूल का मूल्यांकन करना थाBiocontainment वातावरण में वायरस के नमूनों के नकारात्मक धुंधला के लिए एक नई विधि। इस अध्ययन में भी दो अलग-अलग वायरस निष्क्रियता प्रक्रियाओं से बने मंदिर छवियों की गुणवत्ता की जांच की गई: 1) 1% ऑस्मुम टेट्रोक्साइड वाष्प के साथ तेजी से निष्क्रियता, और 2) 2% ग्लूटार्लाहाइड के साथ 24 घंटे की निष्क्रियता। इन दोनों को कैप्सूल का उपयोग करते हुए आयोजित किया गया था। अंत में, हमने कैप्सूल में उपयोग के लिए दो सामान्यतः नकारात्मक दाग, UA और पीटीए का मूल्यांकन किया। 13
Protocol
Representative Results
Discussion
नकारात्मक धुंधला वायरस, प्रोटीन परिसरों और नैनोकणों के मूल्यांकन और आकार देने के लिए एक बहुमूल्य मंदिर तकनीक है। अभिकर्मक से नकारात्मक दाग तक ग्रिड की मैन्युअल रूप से चलने वाले इन नमूनों की बूंदों की…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चिकनगुनिया विषाणु प्रदान करने के लिए शुद्ध ईबोला नैनो-वीएलपी, डॉ रजनी मुधासानी और डॉ चार्ल्स (जेसन) शोएमेकर के लिए डॉ। जॉन कैरा और रोवेना शोकमैन को धन्यवाद देना चाहते हैं और डॉ। चार्ल्स (जेसन) शॉइमेकर को मुरिन ल्यूकेमिया वीएलपीज़ को ईबोलावियरस ग्लाइकोप्रोटीन व्यक्त करते हैं। हम प्रयोगशाला सुरक्षा प्रशिक्षण के लिए ग्रीष्मकालीन इंटर्नशिप कार्यक्रम (एसआईपी) और साइंस एंड इंजीनियरिंग एपेंटिसशिप प्रोग्राम (एसईएपी) और डॉ कैथरीन विल्हेल्सेन की सुविधा के लिए मैज कार्ल सोफल का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे।
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
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