מדידת In Vivo שינויים עצביים חוץ-תאית במהלך טבעי מתגמל בהתנהגויות של אוגרים סוריים הנשי
Summary
מאמר זה מפרט השימוש של הקלטות amperometric פוטנציאל קבוע באמצעות אלקטרודות סיב פחמן וטכנולוגיה ביוסנסור אנזימטיות כדי למדוד את שחרורו של דופמין, גלוטמט עם רזולוציה טמפורלית גבוהה במהלך טבעי מתגמל התנהגות אוגר נקבה.
Abstract
היכולת למדוד את שחרור נוירוטרנסמיטר בקנה מידה זמן מהיר מאפשר דפוסי עצבית כדי להיות מקושר התנהגויות ספציפיות או מניפולציות; כלי רב-עוצמה ב שחקרתי כבסיס מנגנונים ואת המעגלים. בעוד בטכניקה של microdialysis שימש במשך עשרות שנים כדי למדוד את analyte כמעט בכל עניין במוח, טכניקה זו מוגבל ברזולוציה הטמפורלית. לחלופין, סריקה מהירה וולטמטריה הוא באופן מדויק וגם רגיש ביותר; עם זאת, מאחר שיטה טכנית קשה זו מסתמך על electroactivity של analyte עניין, האפשרות לזהות חומרים nonelectroactive (למשל, את גלוטמט נוירוטרנסמיטר) חוסלה. מאמר זה מפרט את השימוש של מערכת הובלת המשלבת פוטנציאל קבוע amperometry biosensing אנזימטיות כדי למדוד נוירוטרנסמיטורים הן electroactive והן nonelectroactive עם דיוק טמפורלית. הזיווג של אלה שתי טכניקות חזק מאפשר לשקילת טוניק והן עצבית phasic בקלות יחסית, וכן מאפשרת הקלטה של נוירוטרנסמיטרים מרובים בו-זמנית. המטרה של כתב יד זה היא להדגים את התהליך של מדידה דופמין, גלוטמט עצבית ויוו השימוש בהתנהגות מתגמלת באופן טבעי (כלומר, התנהגות מינית) באוגרים הנקבה, עם המטרה הסופית של הצגת הישימות הטכנית של זה וזמינותו לבחינת אחרים התנהגויות, פרדיגמות ניסיוני.
Introduction
היכולת למדוד את שחרור נוירוטרנסמיטר בבעלי להתנהג ער מאפשר לחוקרים לקשר התנהגויות ספציפיות עם יכולות דפוסי עצבית-a כלי רב עוצמה כדי לחקור מנגנונים ואת המעגלים שבבסיס שניהם טבעי והתנהגויות operant בזמן אמת. מבחינה היסטורית, microdialysis כבר מועסקים למדוד חומרים גם תגובתי חשמלית וגם nonreactive ב חצרו חוץ-תאי המוח1. שיטה זו משתמשת זרימה רצופה של תמיסה מימית הקומפוזיציה יוניים דומה לנוזל חוץ-תאית, באמצעות בדיקה microdialysis מורכב של מוט קטן עם טיפ עשוי קרום הולופייבר semipermeable2. לאחר ההוספה של המכשיר, נוירוטרנסמיטרים או אחרים analytes עניין יכול לחצות את ממברנה חדירה למחצה על ידי דיפוזיה פסיבית לפני נאסף במרווחי זמן לצורך ניתוח מאוחר יותר על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (hplc, קורס), כימיה אנליטית טכניקה בדרך כלל מנוצל כדי להפריד, לזהות, ולכמת את הרכיבים השונים תערובת הטרוגנית3.
למרות microdialysis היא טכניקה רגיש יכול לשמש כדי למדוד את analyte כמעט לכל עניין, הפתרון הזמני הוא נמוך, עם שיעורי דגימה מקסימלית הסדר דקות ועד עשרות דקות1,2. ההמצאה של סריקה מהירה וולטמטריה (FSCV), טכניקה המסתמך על הפוטנציאל חמצון-חיזור של מינים electroactive, יכול להבהיר ליד ריכוזי מיידית analyte של עניין נוזל חוץ-תאי. בקצרה (ראה רובינסון. et al. 4 עבור סקירה מקיפה), אלקטרודה מוחל על מעלים ומורידים את המתח אופנה גל משולש על סולם הזמן המהיר4. כאשר המתח בטווח הנכון, המתחם עניין שוב ושוב מחומצן, מופחתת. Oxidization וצמצום התוצאה תנועה של אלקטרונים שיוצר זרם חילופין קטן. סרוק את המחירים מתקיים בסולם פחות משנייה עם oxidization וצמצום של תרכובות המתרחשים במיקרו. על ידי הפחתה של הרקע הנוכחי שנוצרו על ידי המכשיר הנוכחי וכתוצאה מכך אחד ניתן ליצור מתח לעומת ייחודית לכל המתחם הנוכחי עלילה. מאז ציר הזמן של תנודות מתח ידוע, נתונים אלה ניתן לחשב מגרש של הזרם כפונקציה של הזמן. לפיכך, הריכוזים היחסיים של המתחם עשוי להיקבע כל עוד מספר האלקטרונים מועברים ב כל חמצון, הפחתת התגובה ידועה4.
זו ירידה לפרטים כימיים ברזולוציה הטמפורלית גבוהה הופכים FSCV טכניקה חזקה לגילוי שינוי ריכוזים כימי ויוו. עם זאת, למרות היתרונות הללו סעפת, טכניקה זו דורשת מומחיות טכנית, ציוד יקר, תוכנית ההתקנה. יתרה מזו, nonelectroactive נוירוטרנסמיטורים (למשל, גלוטמט) לא ניתן למדוד בעזרת טכניקה זו. למרבה המזל, פיתוחים טכנולוגיים בתחום של אלקטרוכימיה5, וכן המסחור של ההמצאות האלו, הציג גישה פשוטה יחסית כדי למדוד את הלא-electroactive נוירוטרנסמיטורים בבעלי להתנהג ער מבלי להתפשר על זמני דיוק-a טכניקה המכונה טכנולוגיית ביוסנסור אנזימטיות. שיטה זו משתמשת אנזימטי המרה של נוירוטרנסמיטר nonelectroactive עניין לתוך שני מצעים, שאחת מהן היא electroactive חמצן שמזוהה בשם הנוכחי חמצון בעל דירוג amperometric שנוצר על ידי הפוטנציאל אפלייד5 . הגששים ביוסנסור זמינים מסחרית (ראו איור 1) למדוד באופן סלקטיבי analytes עניין על-ידי הפחתת והשמה התרומה של interferents אנדוגני. במקרה של גלוטמט, התרומה של חומצה אסקורבית interferent (AA) נפוצות והשמה תקטן הזרם נמדד על ידי שיתוף לוקליזציה אוקסידאז AA על גבי המשטח אנזימטי פעיל של החיישן, המרת AA הלא-electroactive dihydroascorbate ומים. בנוסף, שכבה פולימר Nafion טעונים שלילית נוכח מתחת לשכבת האנזים אינו כולל תרכובות anionic אנדוגני.
הגדרת הניסוי באותו הזה ביוסנסור יכול למדוד נוירוטרנסמיטורים electroactive כמו FSCV, אבל במקום זה היא מעסיקה פוטנציאל קבוע הקלטה6. בניגוד המתח נדנוד המוחלת ב- FSCV, בהקלטה פוטנציאל קבוע המתח נשמרת ב חמצון-חיזור פוטנציאל analyte עניין. למרות שהוא פחות מבחינה כימית סלקטיבית יותר FSCV כמו נוירוטרנסמיטורים מרובים חמצון-חיזור אותו פוטנציאל, באזורים במוח באופן גורף להטות לכיוון אחד מוליך עצבי, הטבע מפתח הפעלה של גישה זו עולה חוסר כימית ירידה לפרטים.
היכולת למדוד גם electroactive וגם nonelectroactive עצבי במהדורה ליד בזמן אמת ולקשר אותה לאירועים התנהגותיים ספציפיים מספק הזדמנות לבחון את שחרור נוירוטרנסמיטר מתכנסים. כתב יד זה מפרט את השימוש במערכת זו לחקור עצבית דופמין והן גלוטמט בתגובה תגמול טבעי ב ער אוגרים להתנהג. מטרת מאמר זה היא לפרט את התהליך של מדידה זה שחרור נוירוטרנסמיטר במהלך התנהגות מינית אוגרים הנקבה, במטרה להפגין את ההיתכנות לבחינת אחרים התנהגויות, פרדיגמות ניסיוני.
אוגרים הם מודל אידיאלי לשימוש בהקלטות אלקטרוכימי
מבחינה היסטורית, מודלים עכברוש ועכברים יש כבר מועסקים במחקר של התנהגות מינית. מינים אלה מכרסמים לעסוק רצף copulatory דינמי, מעורבים התנהגויות שידול נקבה רבים כוללים מקפץ, יקדו האוזן נענוע לפתות את הזכר לרדוף והר בסופו של דבר את הנקבה7. ההרכבה על ידי הזכר (עם או בלי חדירה נרתיקית) נמשך רק כמה שניות, במהלכן הנקבה עוסקת התנהגות מינית היציבה שלה (הנקרא lordosis) גם רק שניות ספורות לפני חידוש התנהגויות שידול פעיל. דפוס זה של התנהגות, המורכב רמות גבוהות של פעילות וביניהם תקופות קצרות של התזוזה, הוא בעייתי למדידת עצבית בחיות מתנהגות. ראשית, יכולה להיות תנועה חפצים בהקלטות amperometric שאינן קשורות לפעילות עצבית. שנית, ומכניקה משויכת השחרור של הנוירוטרנסמיטרים מסוים באזורים מסוימים במוח. לדוגמה, שחרור דופמין כבר זיווג לפעילות גינקולוגיות ב סטריאטום הגבי ו הגחון8,9, ממצא זה היוו את הבסיס למדידות microdialysis של דופמין בעקבות psychostimulant ניהול10. כי ההתנהגויות שידול נקבה-אופייני ב- most מכרסמים לערב רמות גבוהות של פעילות גינקולוגיות, מיוצגים על-ידי עיקר מבחן ההתנהגות המינית 10 דקות, זה מקשה לייחס שינויים עצבית מרכיבי התנהגות מינית מפורשת באופן קולקטיבי מעמד רק . דקות.
כדי לנתח את הפרופיל עצבית של התנהגות מינית נשית, המעבדה הזאת חיפשה זן בהם יש פעילות מינימלית גינקולוגיות המלווה התנהגות מינית. רצף copulatory אוגרים סורים (Mesocricetus אם לדייק) הינו אידיאלי עבור הקלטות עצבית עקב המחסור של התנהגויות שידול טיפוסי אצל חולדות, עכברים11. כתוצאה מכך, אוגרים הנקבה להזין ולשמור על היציבה lordosis עבור למעלה מ- 9 דקות מתוך 10 דקות בדיקות הפעלה12. עם חוסר תנועות גינקולוגיות חיצוניים באמצעות ה נקבה, ויוו ניתן להשיג הקלטות אלקטרוכימי, זה יכול להיות קשור עם רכיבים של אינטראקציות מיניות עם הזכר.
Copulatory הקרבות של אוגרים
לאחר המבוא של חיה זכר הגירוי לחדר בדיקות, הזכר יעסקו בתחילה בחקירה anogenital (AI) של הנקבה לפני הרכבה שלה (איור 2א). על מנת הזכר לטעון, הנקבה חייב להניח שהתנוחה מינית לרעיונות המכונה lordosis, שבו היא קשתות אותה בחזרה, הודף את הזנב שלה כך הזכר הרכבה יוכלו לקבל גישה הפין לנרתיק שלה. הזכר לטעון הנקבה, כשהוא לופת את אחוריו עם שתי כפות (איור 2B), ולהתחיל הדיפת בניסיון להשיג intromission הפין (איור 2C). הזכר לטעון את הנקבה (ללא ההכנסה), כמו גם intromit מספר פעמים לפני בסופו של דבר להשגת שפיכה. רצף זה של mounts ו intromissions שמוביל שפיכה הנקרא “התקף copulatory”. הזכרים יהיו מספר התקפי copulatory בתוך מושב בודד.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות פשוטה יחסית, בעיות יכול להיווצר בעת העסקת בטכניקה זו. ראשית, הצבת stereotaxic הגששים. חייב להיות מדויק: בניגוד microdialysis זה דוגמאות ברדיוס רחב יותר של חצרו חוץ-תאית סביב החללית, טכניקה זו מאפשרת רק המידה של נוירוטרנסמיטר במגע ישיר עם המכשיר. שנית, במקרה של ההקלטה סיבי פחמן, עקב רוחב קטן של סיבי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות לתואר ראשון דניאל Korus על עזרתו שמפעיל את הקוד Matlab, אלכס Boettcher לתואר ראשון שלו לסיוע בניהול ניסויים התנהגותיים. פרויקט זה נתמך על ידי ה-NSF IOS 1256799 כדי R.L.M., ועל -ידי המכון הלאומי על שימוש בסמים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר T32DA007234.
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
