पौध प्रवर्तक विश्लेषण: आम बीन में मूल पिंडी विशिष्ट प्रवर्तक की पहचान और लक्षण वर्णन
Summary
प्रवर्तक अभिव्यक्ति विश्लेषण जीन विनियमन और लक्ष्य जीन की spatiotemporal अभिव्यक्ति की समझ में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस के साथ साथ हम एक प्रोटोकॉल की पहचान करने के लिए प्रस्तुत, अलग, और एक संयंत्र प्रवर्तक क्लोन । इसके अलावा, हम आम बीन बालों की जड़ों में पिंडी विशेष प्रमोटर के लक्षण वर्णन ।
Abstract
जीन कोडिंग अनुक्रम के ऊपर अनुक्रम प्रमोटर जुगाड़ के रूप में पद पर हैं । प्रवर्तकों के अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने से जीन विनियमन और लक्ष्य जीनों के spatiotemporal अभिव्यक्ति पैटर्न को समझने में बहुत महत्वपूर्ण हैं. दूसरी ओर, यह भी प्रमोटर मूल्यांकन उपकरण और आनुवंशिक परिवर्तन तकनीक है कि तेजी से कर रहे हैं, कुशल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रतिलिपि । इस अध्ययन में हमने rhizobial सहजीवन-विशिष्ट पिंड स्थापना के spatiotemporal अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच की (नीं) ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों में Phaseolus के प्रवर्तक । संयंत्र जीनोम डेटाबेस और विश्लेषण उपकरण हम पहचान, पृथक का उपयोग करना, और एक transcriptional संलयन में P. नीं प्रमोटर क्लोन chimeric रिपोर्टर β-glucuronidase (गस) गस-बढ़ाया: GFP । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पी एग्रोबेक्टीरियम rhizogenes प्रेरित बालों की जड़ों का उपयोग कर में आनुवंशिक परिवर्तन की एक तेजी से और बहुमुखी प्रणाली का वर्णन । इस प्रणाली के परिवर्तन के बाद 10 से 12 दिनों में ≥ 2 सेमी बालों वाली जड़ें उत्पंन करता है । इसके बाद, हमने पोस्ट-टीका के आवधिक अंतरालों पर Rhizobium inoculated बालों की जड़ों में निं न प्रवर्तक की spatiotemporal अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया । हमारे गस गतिविधि द्वारा दर्शाया परिणाम बताते है कि nodulation की प्रक्रिया के दौरान नीं प्रमोटर सक्रिय था । साथ में, वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे की पहचान करने के लिए, अलग, क्लोन, और आम बीन बालों की जड़ों में एक संयंत्र प्रवर्तक विशेषताएं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल गैर विशेष प्रयोगशालाओं में उपयोग करने के लिए आसान है ।
Introduction
प्रवर्तक महत्वपूर्ण आणविक जैविक उपकरण हैं जो ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के नियमन को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. प्रवर्तकों डीएनए जीन अनुक्रम के अनुवाद दीक्षा codon के ऊपर स्थित अनुक्रम कर रहे है और वे जीन की केंद्रीय नियामक जानकारी ले; इसलिए, उनके सही एनोटेशन और लक्षण वर्णन जीन समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं । अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर, संयंत्र प्रवर्तकों के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, ऊतक विशिष्ट, या विकास-चरण-विशिष्ट और inducible1। transcriptomic प्रौद्योगिकियों में प्रगति, कंप्यूटर मॉडलिंग में सुधार, और विभिन्न प्रजातियों के पौधे के लिए जीनोम दृश्यों की बढ़ती संख्या की उपलब्धता प्रमोटर जुगाड़ की बड़े पैमाने पर भविष्यवाणी की सुविधा है2.
दूसरी ओर, यह भी प्रमोटर मूल्यांकन उपकरण और आनुवंशिक परिवर्तन तकनीक है कि तेजी से कर रहे हैं, कुशल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रतिलिपि । अंय मॉडल संयंत्रों के विपरीत, आम बीन फली के कार्यात्मक लक्षण वर्णन (पी.) जीन मुख्य रूप से Phaseolus सपा के अड़ियल स्वभाव के कारण में बाधा है । स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के लिए । क्षणिक परिवर्तन प्रणालियों तेजी से जीन कार्यात्मक लक्षण वर्णन3अध्ययन के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा । फली सहजीवन अनुसंधान में, फली मेजबान संयंत्र और rhizobial जीवाणु के बीच बातचीत पिंड के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सबसे योग्य मॉडल प्रणालियों में से एक है विशिष्ट जीन और प्रमोटर अध्ययन । अब तक इन symbioses से संबंधित कई फली प्रवर्तकों की विशेषता रही है, यथा, मेडिकागो truncatula PT44, SWEET115, लोटस japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine मैक्स PT5 8, Exo70J9, पी. के. RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, टो15, आदि । सीआईएस तत्वों सीधे जीन विनियमन को प्रभावित । प्रतिलेखन कारक ENBP1A जल्दी nodulin VfENOD12 के एक सीआईएस विनियामक क्षेत्र (− ६९२ bp) के लिए बाइंड कर देता है, और यह primordia Vicia16के पिंड faba में एक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की सुविधा । सीआईएस विनियामक क्षेत्रों का प्रतिस्थापन (− १६१ से − ४८ बीपी) पिंड-विशिष्ट प्रवर्तक leghemoglobin GLB3 के heterologous के साथ कटा हुआ प्रवर्तकों δ-p35S और δ-pNOS, पिंड विशिष्टता और कम प्रमोटर गतिविधि की हानि के परिणामस्वरूप17 .
पिछली रिपोर्टों से पता चलता है कि प्रतिलेखन कारक जड़ बालों की कोशिकाओं में rhizobial संक्रमण की दीक्षा के लिए नीं आवश्यक है और एल japonicus18में पिंड organogenesis के लिए भी आवश्यक है । वर्तमान अध्ययन में, हम पहचान, अलगाव, क्लोनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और आम बीन बालों की जड़ों में पिंड-विशिष्ट प्रमोटर के लक्षण वर्णन । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम एक rhizobial सहजीवन-विशिष्ट नीं प्रवर्तक का चयन किया और एक transcriptional फ्यूजन में chimeric रिपोर्टर गस को क्लोन-बढ़ाया:: GFP । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पी. ए. rhizogenes प्रेरित बालों की जड़ों का उपयोग कर में आनुवंशिक परिवर्तन की एक तेजी से और बहुमुखी प्रणाली का वर्णन । इस प्रणाली से कम 2 हफ्तों में परिवर्तन के बाद बालों जड़ों उत्पंन करता है । अंत में, हम गस धुंधला द्वारा rhizobia बृहदांत्र जड़ पिंड में नीं प्रमोटर की spatiotemporal अभिव्यक्ति का आकलन किया ।
यहां वर्णित प्रक्रिया न केवल nodulation और फली संयंत्रों के mycorrhization11 के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकती है, लेकिन यह भी जड़ें19में प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन के लिए । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल गैर विशेष प्रयोगशालाओं में उपयोग करने के लिए आसान है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के दौरान, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन vivo मेंजीन के स्थानिक और लौकिक विनियमन को समझने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक अच्छी तरह से ज्ञात विधि जीन अभिव्यक्ति पै…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से Dirección जनरल डी Asuntos डेल पर्सनल Académico, DGAPA/PAPIIT-उणां (अनुदान सं द्वारा समर्थित किया गया था । एम. एल. और IA205117 को एम-के IN219916 । क) तथा द Consejo Nacional डे Ciencia y Tecnològia (CONACYT अनुदान सं. २४०६१४ ते एमएल).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
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