植物プロモーター解析: 同定とルート、インゲンの根粒特異的プロモーターの解析
Summary
プロモーター発現解析は遺伝子の規則の理解と標的遺伝子発現の時空間を改善するために重要です。ここを識別、分離、および植物プロモーターのクローンを作成するためのプロトコルを提案する.さらに、一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターの特性について述べる。
Abstract
シーケンスを符号化する遺伝子の上流の配列は、プロモータ配列として名づけられます。プロモーターの発現パターンを勉強している非常に重要な遺伝子発現制御と標的遺伝子の時空間の発現パターンを理解します。その一方で、プロモーター評価ツールと、高速で効率的、かつ再現性のある形質転換技術の確立に重要ですも。この研究では、遺伝子組換えの毛状根のインゲンの根粒菌の共生固有結節創業 (NIN) プロモーターの時空間の発現パターンを調べた。植物ゲノム データベースと我々 を識別、分析ツールを使用して孤立してキメラの記者に転写融合でP. 尋常性ニン プロモーターをクローン (GUS) の β-グルクロニダーゼ活性ガス enhanced::GFP。さらに、このプロトコルは、 P. 尋常性サツマイモネコブセンチュウによる毛状根を用いた遺伝的変容の迅速かつ汎用性の高いシステムを説明します。このシステムでは、変換後 10 〜 12 日間で ≥2 cm 毛状根を生成します。次に、根粒菌接種後接種の定期的な間隔で毛状根におけるニン プロモーターの時空間表現を評価しました。ガスの活動によって描かれた結果表示ニン プロモーターが根粒形成のプロセス中にアクティブだった。一緒に、この議定書は、識別、分離、クローン、および一般的な豆毛状根の植物プロモーターを特徴付ける方法を示します。さらに、このプロトコルは、非専門の所で使いやすいです。
Introduction
プロモーターは、興味の遺伝子の発現調節機構を理解する上で重要な役割を果たす重要な分子生物学的ツールです。プロモーターは、dna 塩基配列を上流にある翻訳の系列の遺伝子の開始コドンと彼らを運ぶ遺伝子の中央の規制情報したがって、正しい注釈、特性は、遺伝子の機能を理解することに不可欠です。発現パターンに応じて植物プロモーターは、構成、組織固有または開発段階固有および誘導の1として分類されます。トランスクリプトーム技術、コンピュータ モデルの改善および別の植物種のためのゲノム配列の数の増加の可用性の進歩はプロモーター配列2の大規模な予測を容易にしました。
その一方で、プロモーター評価ツールと、高速で効率的、かつ再現性のある形質転換技術の確立に重要ですも。他のモデル植物とは異なり、豆マメ (P. 尋常性) の共通の遺伝子の機能解析はインゲンマメsp 安定な形質転換のための反抗的な性質のために主に阻害します。一時的な変形システムは、迅速な遺伝子機能解析研究3のための代替として機能します。マメ科共生研究のマメ科植物と根粒菌の相互作用は、根粒特異遺伝子のプロモーターの研究機能の解析に最も扱いやすいモデル システムの 1 つです。これまでのところ、これらの共生に関連するいくつかのマメ科植物プロモーターがされている特徴、すなわち、ウマゴヤシ分子PT44SWEET115、ミヤコグササイクロプス UBQ6VAG17、グリシン最大 PT58Exo70J9, P. 尋常性RbohB10、11,12、TRE113、PI3K14、TOR15、など。Cis要素直接遺伝子に影響を与えます。転写因子 ENBP1A は初期 nodulin VfENOD12 のCisの規制地域 (−692 bp) に結合し、これはソラマメ16の根粒原基におけるレポーター遺伝子の発現を促進します。Cisの規制領域の置換 (−48 bp −161) 根粒特異プロモーターの異種のレグヘモグロビン GLB3 プロモーター δ p35S と δ pNOS、根粒特異性の損失で起因し、プロモーター活性17 低下.
以前のレポートを示す転写因子ニン根毛細胞における根粒菌感染の開始に必要なミヤコグサ18根粒器官形成に欠かせないも.現在の研究では、識別、分離、クローニングおよび一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターのキャラクタリゼーションのためのプロトコルについて述べる。、これを達成するためには、 P. 尋常性の根粒菌共生固有ニン プロモーターを選択され、キメラ記者 GUS enhanced::GFP 転写融合のクローンします。さらに、このプロトコルでは、 A. 体の獲得による毛状根を用いたP. 尋常性における遺伝的変換処理の迅速かつ汎用性の高いシステムについて説明します。このシステムは、変換後の 2 週間以内に毛状根を生成します。最後に、GUS 染色によって植民地化された根粒菌根粒でニン プロモーターの時空間の発現を検討しました。
ここで説明する手順は、だけでなく、マメ科植物の根粒形成と mycorrhization の11の研究でも根19プロモーター発現パターンの調査のために役立ちます。さらに、このプロトコルは、非専門の所で使いやすいです。
Protocol
Representative Results
Discussion
遺伝子の機能解析の中には、遺伝子発現パターンの研究は生体内で遺伝子の空間的で、一時的な規則を理解する上で重要な役割を果たしています。遺伝子発現パターンを勉強するよく知られているメソッドは、興味の遺伝子プロモーター領域のクローンを作成する蛍光マーカー遺伝子(GFP、RFP 等)など β-グルクロニダーゼ レポーター遺伝子の上流。ここで、ルート結節の共生 (RNS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は部分的に総局・ デ ・ Asuntos ・ デル ・によって支えられた個人的な Académico、DGAPA/PAPIIT-ウナム (付与なし。蘇州妙林鋼と M K に IA205117 IN219916A) と国立ナシオナル デ サイエンス y Tecnològia (CONACYT グラント号 240614 ミリリットルに)。
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
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