Elektrofysiologisk inspelning från<em> Drosophila</em> Trichoid Sensilla som svar på luktämnen med låg volatilitet
Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att visa hur man presenterar luktämnen med låg volatilitet för enkel sensilluminspelning från Drosophila olfaktoriska receptorns neuroner som svarar mot långkedjiga kikulära feromoner.
Abstract
Insekterna är beroende av luktsinnehållet för att styra ett brett spektrum av beteenden som är avgörande för deras överlevnad, såsom matssökande, rovdjur undvikande, oviposition och parning. Mylära kemikalier med varierande volatiliteter har identifierats som naturliga luktämnen som aktiverar insektolfaktorreceptorneuroner (ORN). Studier av olfaktoriska reaktioner på luktämnen med låg volatilitet har emellertid hindrats att effektivt presentera sådana stimuli med användning av konventionella lukt-leveransmetoder. Här beskriver vi ett förfarande som möjliggör en effektiv presentation av luktämnen med låg volatilitet för in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Genom att minimera avståndet mellan luktkällan och målvävnaden möjliggör denna metod användningen av biologiskt framträdande men hittills otillgängliga luktmedel, inklusive palmitolsyra, en stimulerande feromon med en påvisad effekt på ORN som är involverade i fängelse och parningsbeteende 1 .Vårt förfarande ger sålunda en ny aveny för att analysera en mängd lågflyktiga luktämnen för studier av insektoljig och feromontommunikation.
Introduction
Drosophila ORNs reagerar på ett stort antal luktmedel med många kolkedjelängder och många olika funktionella grupper, inklusive estrar, alkoholer, ketoner, laktoner, aldehyder, terpener, organiska syror, aminer, svavelföreningar, heterocykliska föreningar och aromater 2 , 3 . Luktämnen varierade i deras fysikalisk-kemiska egenskaper kan ha märkbart olika volatiliteter, vilka indikeras av föreningens ångtryck. I synnerhet skiljer sig biologiskt relevanta luktämnen för Drosophila melanogaster enormt i deras volatilitet. Exempelvis svarar Ir92a ORNs på ammoniak 4 , vilket är mycket flyktigt, med ett ångtryck av 6,432 mmHg vid 20 ° C. I motsats härtill svarar Or67d ORNs på en maleferomon, cis- va-acetylacetat ( c VA) 5 , 6 , vars ångtryck är 43 mmHg vid 20 ° C.
Ove_content "> Att studera det olfaktoriska svaret på luktämnen med låg volatilitet är särskilt utmanande med konventionella lukt-leveransmetoder, där luktämnen levereras via en bärarluftström över ett relativt långt avstånd ( dvs flera centimeter). Som sådana rapporteras de rapporterade olfaktoriska svaren Till en given luktämne med låg volatilitet kan variera kraftigt beroende på utformningen av luktleveranssystemet. Exempelvis varierar det rapporterade svaret från Or67d ORN till en hög dos av c VA från ~ 40 7 -> 200 spikar / s 6 . Dessutom är den ineffektiva leveransen av c VA med konventionella leveransmetoder sannolikt hänförlig till falskt negativa resultat vilket leder till den tolkning som c VA i sig inte är tillräcklig för att aktivera Or67d ORNs 8. Denna tolkning utmanades senare av en annan studie med användning av en Lukt-leveransmetod 9. Det är därför imperaTenderar att utveckla ett starkt lukt-leveranssystem för effektiv presentation av luktmedel med låg volatilitet.Nyligen identifierade vi flera långkedjiga kutikulära fettsyror som ligander för Or47b ORNs. De är inrymda i typ 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Bland de långkedjiga fettsyrarelektorerna fann vi att palmitolsyra fungerar som en afrodisiakumferomon som främjar hankönskap genom att aktivera Or47b ORNs 1 . I en annan studie med användning av en konventionell lukt-leveransmetod, visade sig metyllaurat att framkalla svar från Or47b ORN, medan palmitolsyra framkallade inget svar när det presenterades från samma avstånd 10 . Jämfört med c VA är långkedjiga fettsyror ännu mindre flyktiga, med ångtryck mindre än 0,001 mmHg vid 25 ° C 11 . Den iboende låga volatiliteten hos långkedjiga fettsyrar luktämnen, vilket utesluter effektiv presentation till antennen viaKonventionella lukt-leveranssystem, som sannolikt utgjorde de falsk-negativa resultaten 10 . Denna inkonsekvens belyser otillräckligheten hos konventionella lukt-leveranssystem vid framställning av lågflyktiga luktmedel. Det visades tidigare att den effektiva leveransen av fluga-kutikulära lukt kräver närhet mellan luktkällan och målvävnaden 6 . För att fullständigt karakterisera effekterna av biologiskt aktiva feromoner samtidigt som vi efterliknar avståndet från vilka de sannolikt drabbas av fruktflugor i naturen 12 , 13 , kom vi överens om att minimalt avstånd måste prioriteras högt i vår procedur.
Vår metod har ytterligare fördelar, bland annat kompatibilitet med standard elektrofysiologiska riggar och tekniker. För befintliga rigguppsättningar kräver minimal ändring för att tillgodose detta protokoll, och de flesta SSR-steg kräver endast mindre justeringar. DettaGör vår teknik lätt tillgänglig för forskare som är erfarna i SSR. Dessutom möjliggör vår teknik att presentationen av luktar med låg volatilitet med skarp start och offset, korrelerande stimulansavgivning med neuronrespons. Slutligen underlättar hårdvarulayouten snabba utbyten mellan luktpatroner, vilket ökar datainsamlingen över ett önskat doseringsintervall.
Vi börjar med att granska beredningen av referens- och inspelningselektroder, lösning för vuxna hemolymph-liknande (AHL), luktmedelspatroner och motsvarande olfaktometer. Vi diskuterar sedan beredningen av palmitolsyra luktlösningarna, följt av förberedelsen av fluga för inspelning. Vi fortsätter att överväga kriterierna för att välja en trichoid sensillum att registrera och granska närmare luktpatronens positionering innan vi presenterar representativa data som förvärvats med denna metod. Slutligen slutar vi med att utforska användbara tillämpningar av denna teknikOj, vissa problem, och deras lösningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrives ett förfarande genom vilket svaren från Or47b ORN till palmitolsyra kan induceras och registreras robust. Vi modifierade en konventionell långdistansluktleveransmetod 2 , 7 , 10 för att felsöka problemet med otillräcklig feromon luktmedel. Vi tog upp frågan om volatilitet med låg luktvätska genom att leverera föreningen via luktkartor, vars öppning är placerad i millimeter av prep. När hänsyn tas ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ye Zhang för hjälp med provspåren och Tin Ki Tsang för hjälp med bilderna. Detta arbete stöddes av ett Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award och ett NIH-bidrag (R01DC015519) till C.-YS och NIH-bidrag (R01DC009597 och R01DK092640) till JWW
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
