القابلية للذوبان في مجمعات الماء في المحلول باستخدام تركيبات من تجميع ذاتي الببتيد والأحماض الأمينية
Summary
ويصف هذا البروتوكول وسيلة المطبقة سريرياً تذويب مسعور المركبات في بيئة مائية باستخدام تركيبات من تجميع حلول الببتيد والأحماض الأمينية ذاتيا. لدينا أسلوب يحل قيداً رئيسيا للمداواة مسعور، التي تفتقر إلى وسائل آمنة وفعالة لأساليب الذوبان وإيصالها إلى إعدادات السريرية.
Abstract
تجميع ذاتي الببتيدات (برامج التكيف الهيكلي) مركبات واعدة لتقديم العلاجات مسعور للتطبيقات السريرية؛ خصائصها amphipathic تسمح لهم بحل مسعور المركبات في البيئة المائية للجسم البشري. غير أن تجميع ذاتي الببتيد الحلول لها الدم سوء التوافق (مثلاً، انخفاض الاسموليه)، التي تعوق تطبيقها السريري من خلال الإدارات عن طريق الحقن الوريدي. وقد وضعنا مؤخرا منصة معمم لإيصال الأدوية مسعور، الذي يجمع بين برامج التكيف الهيكلي مع حلول حمض أميني (SAP-AA) لتعزيز قابلية الذوبان في المخدرات وزيادة اسموليه صياغة للوصول إلى متطلبات الاستخدامات السريرية. هذه الاستراتيجية صياغة تم اختبارها بدقة في سياق ثلاث مجمعات مسعور هيكلياً مختلفة – PP2، روتليرين، والكركمين – من أجل إثبات براعة. وعلاوة على ذلك، قمنا بدراسة آثار التغير في وضع المكونات من خلال تحليل 6 مختلف برامج التكيف الهيكلي، 20 من الأحماض الأمينية الموجودة بطبيعة الحال في التركيزات المنخفضة والعالية، وهما مختلف المذيبات المشارك ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) والايثانول. ولوحظ استراتيجيتنا أثبتت فعاليتها في تحسين مكونات معينة من المخدرات مسعور، والوظيفة العلاجية لمثبطات صياغتها، PP2، سواء في المختبر و في فيفو. ويوجز هذه المخطوطة لدينا أسلوب صياغة المعمم استخدام تركيبات SAP AA لمركبات مسعور، وتحليل للذوبان كخطوة أولى نحو إمكانية استخدام هذه الصيغ في دراسات أكثر وظيفية. نحن تشمل نتائج الذوبان الممثل لصياغة الكركمين المركب، مسعور، ومناقشة كيفية منهجيتنا بمثابة منبر للدراسات البيولوجية في المستقبل ونماذج المرض.
Introduction
برامج التكيف الهيكلي هي فئة من المواد الحيوية التي درست على نطاق واسع السقالات 3D في الطب التجديدي1،2،،من34. في الآونة الأخيرة بيد أنهم استغلوا كوسائل لإيصال المداواة بسبب تلك الخصائص البيولوجية الفريدة5،6،،من78. وبطبيعة الحال تجميع برامج التكيف الهيكلي إلى النانو مستقرة9، مما يوفر وسيلة لتغليف المخدرات والحماية. برامج التكيف الهيكلي أمفيباثيك، تتألف من نمط معين من يكرر مسعور وماء من الأحماض الأمينية، القيادة على التجميع الذاتي9،10 ، والسماح لهم بالعمل كوسيط بين مسعور وماء بيئات. ونتيجة لذلك، لإيصال المخدرات مسعور–السريرية التي لديها منخفضة للغاية من التوافر البيولوجي والامتصاص في الجسم بسبب انعدام القابلية للذوبان في البيئات المائية11،12 -برامج التكيف الهيكلي واعدة كتسليم مركبة. وعلاوة على ذلك، يعني على نمط التسلسل أيضا أن برامج التكيف الهيكلي يمكن تصميم عقلانية وهندسيا لتحقيق أقصى قدر من التوافق مع أي مخدر معين أو مركب (أي، استناداً إلى المجموعات الوظيفية) وكذلك مساعدة الذوبان.
وقد طبقت برامج التكيف الهيكلي كوسائل إيصال المخدرات فعالة في كثير من المختبر و في فيفو إعدادات13،14،،من1516. أنها أظهرت أيضا سلامة كبيرة وتوافق مع الحياة. ومع ذلك، نظراً لانخفاض الاسموليه ساب-المخدرات الاستعدادات، أنهم لا يمكن استخدام للحقن الوريدي كما هو الحال في إعدادات السريرية13. نظراً لهذا التقييد، وضعنا مؤخرا استراتيجية الذي يجمع بين برامج التكيف الهيكلي مع حلول حمض أميني بغية الحد من استخدام المذيبات السامة المشارك وزيادة اسموليه صياغة، ومن ثم أهمية سريرية. لقد اختار استخدام الأحماض الأمينية كما هي اللبنات الأساسية لبرامج التكيف الهيكلي، بالفعل قبلت سريرياً، وفي تركيبة مع برامج التكيف الهيكلي، أنها تزيد القابلية للذوبان في الماء من المخدرات في حين خفض مبلغ ساب المطلوبة17،18.
نحن فحص تركيبات ساب-AA كمنبر معمم للذوبان في الماء من المخدرات وتسليم اللاحقة بإنشاء خط أنابيب متعدد خطوة فحص وتطبيقه على مثبط Src، PP2، كنموذج مجمع مسعور. في هذه العملية، قمنا بدراسة تأثير تغيير مكونات صياغة – اختبار 6 مختلف برامج التكيف الهيكلي، كل 20 من الأحماض الأمينية بتركيزات مختلفة 2 (منخفضة وعالية؛ وانخفاض استناداً إلى التركيزات في التطبيقات السريرية الحالية، وارتفاع في نهاية المطاف وكانت التركيزات 2 x أو 3 x 5 x تركيز السريرية استناداً إلى أن القابلية للذوبان كحد أقصى لكل من الأحماض الأمينية في الماء)، والمذيبات المشارك مختلفة 2 – والتركيبات المحددة التي solubilized PP2 لمزيد من التحليل. هذا وضع المخدرات أثبتت فعاليتها كوسيلة إيصال المخدرات في الخلية والثقافة، فضلا عن في فيفو نماذج استخدام الإدارات تحسن وفي الوريد. وبالمثل، لمست عملنا على براعة ساب-AA مجموعات متعددة سولوبيليزينج، مركبات مسعور المختلفة هيكلياً في البيئات المائية؛ على وجه التحديد، المخدرات روتليرين والكركمين18. وتحدد هذه المخطوطة أسلوب صياغة ساب-AA وتحليل قابلية الذوبان في الكركمين كمثال على الخطوة الأولية في خط أنابيب الفحص لدينا. يوفر هذا البروتوكول بطريقة بسيطة، واستنساخه على الشاشة لتركيبات ساب-AA الأمثل، الذي يحل أي مجمع مسعور معين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في صياغة الإجراءات، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ونقاط للنظر في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولاً، كما أننا نعمل مع مختلف مكونات وتجمعات، خطوات دوامة متعددة في جميع أنحاء البروتوكول ضمان جميع التركيزات موحدة وصحيحة. بعض من الحلول مسعور، وتركيزات عالية من الأحماض الأمينية التي لا تزال لا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتدعم هذا العمل “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” والتشغيل يمنح 42546 اجتماع الأطراف واجتماع الأطراف 119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
- Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
- Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
- Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
- Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
- Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
- Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
- Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
- French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
- Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
- Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
- Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
- Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
- Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
- Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
- Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
- Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
- Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).
